间充质干细胞源性外泌体HSP70促进皮肤表皮伤口愈合的机制研究

The degree of apoptosis of keratinocytes plays an important role in skin wound healing. Previous experiments have found that centrifugal purified umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes (hUCMSCs-Ex) can significantly promote the healing of skin wounds on the back of diabetic mice, but the molecular and mechanism of key proteins in Ex that play a role in promoting epidermal wound healing remains unclear. In the previous experiment, mass spectrometry analysis showed that Ex was rich in HSP70, one of the heat shock proteins. HSP70 can regulate caspase-dependent Apaf1 and AIF in the apoptosis pathway of PARP/1-AIF and inhibit apoptosis. Accordingly, the applicant proposed the hypothesis that "HSP70 in Ex regulates PARP-1/AIF signaling pathway, inhibits keratinocytes apoptosis, and thereby promotes epidermal wound healing". The purpose of this study was to obtain hUCMSCs-Ex by ultra-high speed gradient centrifugation combined with the purification kit. In vitro keratinocytes apoptosis and in vivo skin injury models, cell and molecular intervention techniques were applied to verify the key molecules and mechanism of hUCMSCs-Ex in promoting skin epidermal regeneration and healing in the treatment of skin trauma，It provides a certain theoretical basis for the treatment of prolonged non-healing wounds.

角质形成细胞的凋亡程度在皮肤伤口愈合过程中具有重要的影响。前期实验发现：离心纯化的脐带间充质干细胞外泌体（hUCMSCs-Ex）可以显著促进糖尿病小鼠背部皮肤伤口愈合，但Ex中起到表皮伤口促愈作用的关键蛋白分子及机制尚不清楚。在前期实验中通过质谱分析发现Ex中含有丰富的热休克蛋白之一HSP70。HSP70可以调控caspase依赖及PARP/1-AIF凋亡通路中的Apaf1及AIF，抑制细胞凋亡。据此，申请人提出“是否是Ex中的HSP70调控PARP-1/AIF信号通路，抑制角质形成细胞凋亡，进而促进表皮伤口愈合”的假说。本研究旨在利用超高速梯度离心结合试剂盒纯化，获得hUCMSCs-Ex；在体外角质形成细胞凋亡和体内皮肤损伤模型中应用细胞与分子干预技术予以验证，确定hUCMSCs-Ex在治疗皮肤创伤中促进皮肤表皮再生愈合的关键分子及其作用机制，为经久不愈性伤口的治疗提供一定的理论基础。

慢性皮肤伤口愈合涉及包括角朊细胞，成纤维细胞，巨噬细胞等多种细胞间调控紊乱，造成诸如细胞增殖、迁移能力减弱，亦或炎症反应持续性进行，凋亡过度，进而造成伤口久而不愈。课题组前期利用脐带间充质干细胞及其衍生的外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes, hucMSC-Ex），进行了伤口愈合相关的体内外研究，结果显示hucMSC-Ex可以显著促进角质形成细胞（HaCaT）增殖、迁移抑制其过度凋亡，进而体内实验证实与对照组比较其亦可以显著促进小鼠背部皮肤伤口愈合。因此本项目着眼于hucMSC-Ex抑制细胞凋亡的功能，预进一步探索hucMSC-Ex促愈机制。.皮肤损伤修复过程细胞间互作非常重要，我们将研究目标放到了在伤口形成阶段较为重要的细胞之一角朊细胞，愈合过程中因为慢性炎症反应，角朊细胞过度凋亡是造成伤口久而不愈的原因之一。而干细胞衍生物外泌体具有抗炎、抗凋亡的功能。基于hucMSC-Ex显著高表达抗凋亡分子HSP70，在本项目中我们人为过表达及敲低了hucMSC-Ex中的HSP70，应用皮肤角朊细胞研究了hucMSC-Ex促增殖抗凋亡促进愈合的可行性，结合H2O2诱导HaCaT凋亡模型，糖尿病小鼠皮肤伤口模型，体内外研究了加入过表达及敲低表达HSP70的hucMSC-Ex后细胞表型，行为学的改变，伤口愈合速度，愈合后皮肤形态完整性的差异，并分析了HSP70通过线粒体PARP/1-AIF信号通路调控愈合的作用机制。同时为了高效快速获得不同处理组的hucMSC-Ex，结合前期三维扩增种子细胞的经验，利用相同的方式结合超高速梯度离心法，分离获得了体内外实验所需的大量外泌体。.研究结果显示：（1）H2O2可以诱导HaCaT经非caspase依赖线粒体凋亡通路发生凋亡；（2）过表达HSP70后的HaCaT增殖、迁移及抗凋亡能力升高，而敲降后该功能下调；（3）微载体生物反应器三维扩增方式可快速获得实验所需的过表达或敲降表达HSP70的hucMSC-Ex；（4）ExoOE-HSP70显著促进H2O2诱导的HaCaT增殖、迁移，同时抑制凋亡诱导因子（Apoptosis induce factor, AIF）自线粒体进入细胞核发挥凋亡功能；（5）Exosh-HSP70显著促进小鼠皮肤伤口愈合。