Lys63多聚泛素化因子在斑马鱼脊索形成中的作用机制研究

Lys63-polyubiquitination mediates the post-translational modification of target proteins in a non-degradation manner and thus regulates their activities. So far, Ubc13 is the only known ubiquitin-conjugating enzyme (E2) that can work together with its cofactors (Uev1 or Mms2) to mediate Lys63-polyubiquitination. Our previous studies have shown that zebrafish contains Ubc13a, Ubc13b, Uev1A and Mms2, their synergic action can cause Lys63-polyubiquitination of target proteins. In addition, developing embryos of Ubc13-knockout mice and Ubc13-knockdown zebrafish are lethal, but it remains largely unclear about molecular mechanisms underlying the regulation of embryonic development by Lys63-polyubiquitination in vertebrates. The main contents of this project include: 1) the generation of Ubc13a-, Ubc13b-, Uev1A- or/and Mms2-knockout zebrafish mutants for investigation of their roles in embryonic cell apoptosis and notochord formation; 2) the Lys63-polyubiquitination of known E3 enzymes such as Mib in mutant embryos and ZF4 cells; and 3) the roles of Lys63-polyubiquitination in modification of Notch signaling factors and activity of Notch pathway in mutant embryos and ZF4 cells. Allowed the implementation of the project, we will clarify the differential roles of Ubc13a, Ubc13b, Uev1A and Mms2 in the control of embryonic cell apoptosis and Notch signaling pathway activity, reveal the molecular mechanisms for Lys63-polyubiquitination in zebrafish, and thus lay the foundation for a full uncover the function and mechanism of Lys63-polyubiquitination during the development of tissues and organs.

Lys63多聚泛素化是一种非蛋白降解的翻译后修饰和活性调节方式，而Ubc13是迄今已知唯一能介导Lys63多聚泛素化的泛素结合酶。我们发现，斑马鱼中存在Ubc13a、Ubc13b、Uev1A和Mms2，它们协同作用对靶蛋白进行Lys63多聚泛素化。此外，Ubc13敲除小鼠及其敲降的斑马鱼胚胎均死亡，但尚不清楚Lys63泛素化调控脊椎动物发育的分子机制。本项目主要内容为: 1）研制Ubc13a、Ubc13b、Uev1A和Mms2的突变体，研究它们在胚胎细胞凋亡和脊索形成中的作用；2）利用突变体胚胎和ZF4细胞，研究它们对E3酶如Mib的Lys63多聚泛素化作用；3）利用突变体胚胎和ZF4细胞，研究它们对Notch通路因子的修饰和活性调控。该项目的获准与实施，将阐明这些因子在胚胎细胞凋亡和Notch通路活性调控中的功能差异和分子机制，为揭示Lys63泛素化在斑马鱼组织器官发育中的功能奠定基础。

Lys63多聚泛素化是一种非蛋白降解的翻译后修饰和活性调节方式，而Ubc13是迄今已知唯一能介导Lys63多聚泛素化的泛素结合酶。我们发现，斑马鱼中存在Ubc13a、Ubc13b，它们主要生物学作是对靶蛋白进行Lys63多聚泛素化。此外，Ubc13敲除小鼠及其敲降的斑马鱼胚胎均死亡，但尚不清楚Lys63泛素化相关因子在脊椎动物中的功能。本项目主要内容为: 1））研制Ubc13 、Ubc13b、Cldn7b、Nup62l敲除突变体斑马鱼，利用纯合突变体胚胎研究Ubc13\ubc13b等基因在斑马鱼胚胎发育、器官建成中的作用；2）利用突变体鱼和ZF4细胞，研究Ubc13对已知E3酶或底物的Lys63多聚泛素化调控；3）挖掘Ubc13a\Ubc13b在斑马鱼肝脏功能建成中的作用；4） 相关基因cldn7b、nup62l在斑马鱼胚胎发育中的功能研究。我们研究发现：1）Ubc13a,Ubc13b单基因敲除对斑马鱼胚胎发育及器官建成没有明显影响，该突变体能够正常发育繁殖。Ubc13a/ubc13b双基因敲除的斑马鱼突变体，肝脏脂类代谢异常，在第8天出现油滴积累，分子机制研究发现，ubc13a/Ubc13b双突变体中，肝脏脂肪酸β氧化受阻，酮体转运也受到了抑制，AMPK信号通路没有明显变化。2）cldn7b基因的缺失影响了耳泡上皮细胞紧密连接的形成，耳腔内环境的稳态遭到破坏，从而导致斑马鱼耳石发育异常及听力受损；3）nup62l基因敲除突变体的斑马鱼咽弓发育异常。进一步研究发现，nup62l通过调控Wnt/β-catenin 信号通路和细胞凋亡，在斑马鱼咽弓发育中起着重要作用。该项目的实施，阐明了这些基因在胚胎细胞凋亡和Notch、Wnt通路活性调控中的功能差异，为揭示Lys63泛素化相关因子在斑马鱼组织发育和器官功能建成中的功能奠定基础。