外泌体选择性装载lncRNA-ATB介导肝癌细胞糖酵解途径调控CAF自噬的机制研究

Autophagy in cancer-associated fibroblasts(CAFs) have an crucial effect on the development of hepatocellular carcinoma(HCC). However, the regulatory mechanism is still unclear. We found that autophagy in CAFs showed a higher basal level, which can be regulated by glycolysis in HCC. The mechanism may be that glycolysis promoted the releasing of exosomes in the presence of enzyme PKM2；The exosomes can selectively transport lncRNA-ATB from HCC cells into CAFs；Then exosomal lncRNA-ATB regulated the expression of Atg5 at post-transcriptional level to promote autophagy. We hypothesis that PKM2 in HCC promoted the release of exosomes by regulating the expression of YKT6. And exosomal lncRNA-ATB were selectively loaded into exosomes by hnRNPA2B1 to induce autophagy in CAFs. In this research, we will utilize clinical tissue specimens, cell experiments and animal model to build three experiment levels. Using ChIP, EMSA, RIP, RNA pull-down, luciferase report gene and mass spectrum identification to reveal the mechanism of glycolytic pathway in HCC influences the autophagy of CAFs. This study can provide a new strategy for targeted therapy of HCC.

肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)的自噬对于肝癌发生发展产生重要影响，其具体调控机制尚不清楚。我们前期研究发现肝癌CAF基础状态呈现高水平自噬，该过程受到肝癌细胞内糖酵解的影响。糖酵解关键酶PKM2可以促进外泌体大量释放。这些外泌体通过携带lncRNA-ATB进入CAF后，在转录后水平调控Atg5的表达进而促进自噬的发生。我们提出假说：肝癌细胞内PKM2通过调控YKT6的表达促进外泌体的释放，外泌体通过hnRNPA2B1选择性装载lncRNA-ATB介导肝癌CAF自噬发生改变。本项目拟通过临床组织标本、体外细胞实验和动物模型构建三个研究水平，运用ChiP、EMSA、RIP、RNA pull-down、荧光素酶报告基因、质谱鉴定等实验技术揭示肝癌细胞糖酵解途径通过外泌体调控CAF自噬的分子机制，为肝癌的靶向治疗提供新的方向。

肝细胞癌（HCC）是世界范围内导致癌症相关死亡的主要原因之一。每年有超过50万的新病人被诊断出来，其中一半生活在中国。我们前期研究的发现肝癌CAF基础状态呈现高水平自噬，该过程受到肝癌细胞内糖酵解的影响。糖酵解关键酶PKM2可以促进外泌体大量释放，这些外泌体通过携带lncRNA-ATB进入CAF后，在转录后水平调控Atg5的表达进而促进自噬的发生，虽然肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)的自噬对于肝癌发生发展产生重要影响，其具体调控机制尚不清楚。. 首先我们采用自噬标志蛋白 LC3、免疫荧光标记和透射电镜观察自噬小体这三种方法对肝癌 CAF 自噬水平进行了综合评价，发现与癌旁成纤维细胞相比，CAF呈现高自噬水平，随后应用糖酵解抑制剂和糖酵解激活剂培养肝癌细胞，与PBS 对照处理组相比，糖酵解激活组肝癌细胞外泌体释放量增多，而糖酵解抑制组肝癌细胞外泌体释放量减少，表明肝癌细胞糖酵解过程可以影响外泌体释放。收集糖酵解激活组、PBS 对照组来源的肝癌细胞外泌体，采用 lncRNA 芯片分析，选取前 3 位在糖酵解激活组肝癌外泌体中表达增加的 lncRNA，依次在 CAF 中过表达这三种 lncRNA，发现 lncRNA-ATB 过表达对 CAF 自噬水平增加影响最为显著。利用 RIP、RNA-pull down 等实验明确 hnRNPA2B1 可以靶向结合 lncRNA-ATB，从而将 lncRNA-ATB 携带进入外泌体。最后应用 western blot 检测 LC3-II/LC3-I、p62 蛋白表达，发现敲低 ATG5 后逆转 lncRNA-ATB 对自噬的促进，同时生信分析结果显示，lncRNA-ATB 与 ATG5 高度相关，证实了 lncRNA-ATB 通过 ATG5 调控表达促进 CAF 细胞自噬。. 本研究从临床肝癌标本、体外细胞实验和肝癌动物模型三个水平，揭示肝癌细胞糖酵解途径通过外泌体调控CAF自噬的分子机制，为肝癌的靶向治疗提供新的方向。