磷酸化分子修饰提高川牛膝多糖免疫增强活性及分子机理研究

Radix Cyathulae officinalis Kuan polysaccharide can serve as an adjuvant to activate the immune system and enhance the effects of vaccination on specific and non-specific immunity. Numerous studies confirmed that phosphorylated modification enhances the adjuvant activity of polysaccharides from Chinese herbal medicine. Thus, the activity of the RCPS as a highly efficient new-type immunopotentiator should be enhanced. In this study, the total and the fractional polysaccharides of RC will be extracted by using water decoction and one-step or stepwise ethanol precipitation method, respectively, to prepare the phosphorylated polysaccharides. The immune-enhancing activities of phosphorylated polysaccharides in vivo and in vitro were evaluated through a series of experiments. The relative signaling pathway by which phosphorylated polysaccharide activated the immune system was determined by real-time polymerase chain reaction and fluorescence-activated cell sorter. The molecular mechanism by which phosphorylated polysaccharide modulates the immune system was determined by cellular and molecular techniques. We explored the use of phosphorylated modification in improving the immune-enhancing activity of polysaccharides and determined which phosphorylated polysaccharides showed the best results. Our findings offer theoretical evidence for the development of a novel immunopotentiator. This new idea will be of great significance in developing new veterinary drugs, improving the prevention and control of animal infectious diseases, and in protecting animal husbandry.

前期的研究表明川牛膝多糖具有显著的免疫增强作用，但其免疫活性仍需进一步提高。近期预研发现磷酸化分子修饰可进一步提高川牛膝多糖的免疫增强活性，在此基础上本实验拟选择川牛膝为研究对象，分别提取其总多糖与分级多糖，通过正交法进行磷酸化分子修饰获得磷酸化川牛膝多糖组分；通过体内外试验，系统的研究磷酸化川牛膝多糖免疫增强作用；为深入研究其分子机制，拟通过荧光定量PCR和流式细胞术等手段明确磷酸化川牛膝多糖提高机体免疫应答的途径，再进一步深入研究其启动免疫应答的下游信号转导通路，从细胞水平和分子水平充分揭示磷酸化修饰的川牛膝多糖作为佐剂对动物免疫应答的调控机制。通过上述实验从多个磷酸化多糖组分中筛选出活性最强的多糖组分，为研制开发高效、安全的新型免疫增强剂奠定基础。本研究不仅对开辟新药源、保证中药的可持续发展具有重要价值，而且对提高动物疫病尤其是重大疫病的防控效果、保障健康养殖具有重大意义。

畜牧生产上很多疫苗的免疫效果并不理想，免疫增强剂的研发成为研究的热点。本项目首先通过正交法对川牛膝多糖进行磷酸化分子修饰优选出最佳合成工艺；通过FTIR，SEM对其产物进行了鉴定及理化性质研究；通过体内外试验，系统的研究了pRCPS作为疫苗佐剂对机体免疫反应的影响及分子机理；对免疫低下小鼠免疫功能的影响；在体外的抗病毒活性。为开发新型免疫增强剂的先导化合物提供依据。结果表明：（1）pRCPS最优修饰条件为：当STMP和STPP的比例为1：4，反应温度为4℃，反应时间为2h。FTIR鉴定pRCPS合成成功。SEM及化学试验明确了其各种理化性质。（2）pRCPS与口蹄疫疫苗协同免疫小鼠能显著上调特异性抗体水平，脾淋巴细胞增殖能力，CTL 和NK杀伤活性，Th1/Th2型细胞因子的表达水平，共刺激分子在DCs上的表达。综上，磷酸化修饰可提高RCPS的免疫增强活性，其机制可能是通过促进DCs成熟上调体液和细胞免疫反应。（3）pRCPS显著提高免疫低下模型小鼠的脾和胸腺指数，淋巴细胞增殖能力，巨噬细胞的吞噬活性，血清IgG、IgM和IgA水平。可见，pRCPS可以减轻Cy诱导产生的免疫抑制作用。（4）pRCPS作为佐剂与乙肝亚单位疫苗协同免疫ICR小鼠能显著提高抗体水平，NK/CTL杀伤活性，T细胞的增殖，巨噬细胞的吞噬活性，Th1/ Th2型细胞因子的水平。此外，促进DCs 表面分子的表达，上调T-bet 和GATA-3 mRNA表达水平，下调Treg细胞的表达百分比。pRCPS可能通过促进DCs成熟，下调Treg细胞的表达来启动免疫应答，其分子机制可能通过同时上调T-bet 和GATA-3 mRNA表达水平调控初始T细胞同时向Th1/ Th2方向发育和分化，诱导产生平衡的Th1/Th2型反应，同时增强细胞和体液免疫反应。（5）筛选出4种产物（pRCPS1-4）在三种加药方式下均表现出显著的抗病毒活性并优于未磷酸化改性的RCPS，其抗病毒活性与磷酸根接枝量有关，与有机酸含量无关。综上，pRCPS1-4有潜力开发成新型的抗犬细小病毒的化合物，此外，磷酸化修饰技术也有望成为提高多糖抗病毒活性的一种有效方法。本研究发表SCI论文7篇，影响因子大于2的6篇，JCR（1区）3篇，影响因子均是4.811，还有2篇在投稿中。申请专利2项，已授权1项，参加学术会议4次，做大会报告1次。