铜绿假单胞菌毒素-抗毒素系统HigB-HigA对三型分泌系统的调控机制研究

Persisters are a major cause of chronic and recalcitrant infection. Toxin-antitoxin (TA) systems play an important role in the persister formation. However, the roles of TA in gene regulation and bacterial physiology need further studies..We have found that a TA system HigB-HigA is involved in the persister formation of Pseudomonas aeruginosa (PA). Transcriptomic analysis revealed an upregulation of the type III secretion system (T3SS) genes in the higA::Tn mutant. The T3SS is an important virulence factor, which injects effector proteins into host cells and cause cell death, thus protecting the bacterial from immune clearance. Overexpression of higB increased the T3SS expression and cytotoxicity to macrophages. Therefore, we hypothesize that during the formation of persisters, HigB up regulates the T3SS and subsequently protects the persister cell from host killing. We plan to study the mechanism of HigB-HigA mediated regulation of T3SS; the levels of T3SS expression and cytotoxicity of persister. Methods of molecular biology and cell biology will be applied..The results of this project will shed light on the mechanism of gene regulation and physiology of persister cells, which might facilitates the understanding of persister cells’ characteristics and provide clues for the clearance of persister cells.

高耐药持留菌是导致慢性和顽固性感染的重要原因之一。毒素-抗毒素（TA）系统在持留菌形成过程中起重要作用。然而TA对细菌基因表达和生理状态的影响还未被完全了解。.我们前期发现铜绿假单胞菌（PA）中的一个TA系统HigB-HigA与持留菌形成相关。转录组分析显示，抗毒素基因higA缺失导致三型分泌系统（T3SS）基因全部上调。T3SS引起宿主细胞死亡，是PA抵御免疫细胞清除的重要机制。我们发现过表达毒素基因higB也会提高T3SS的表达，并使细菌杀巨噬细胞能力增强。据此我们猜想，PA在形成持留菌过程中，会通过HigB提高T3SS的表达水平，为逃逸免疫细胞的清除提供基础。本项目拟采用分子生物学和细胞学等手段进行以下研究：HigB-HigA调控T3SS的机制；持留菌T3SS的表达水平及杀细胞能力。.本项目结果将解析持留菌的基因表达调控机制及生理状况，为充分认知持留菌生物学特性及清除持留菌提供基础。

持留菌是细菌群体中高度耐药的一小部分个体，是导致慢性和顽固性感染的重要原因之一。毒素-抗毒素（TA）系统通过影响细菌的生长调控持留菌的形成。我们前期发现铜绿假单胞菌（PA）中的一个TA系统HigB-HigA与持留菌形成相关，且抗毒素基因higA缺失导致毒力因子三型分泌系统（T3SS）基因全部上调。本项目旨在解析HigB-HigA调控T3SS的机制，为此我们从T3SS、耐药机制和调控通路等多个角度进行了研究。1. 细致研究了T3SS的调控机制，发现Fis蛋白对T3SS的调控通路和新型T3SS下游蛋白；2. 按计划研究了调控T3SS的小RNA RsmY，RsmZ以及CrcZ的表达，发现核酸酶YbeY影响RsmY，RsmZ的表达，代谢酶TpiA通过影响CrcZ调控T3SS，RNA酶PNPase影响小RNA P27的表达;3.为了阐明持留菌的基因表达状况，研究了持留菌的转录组，发现了新型持留菌形成相关基因；4. 从细菌响应抗生素角度研究可能的调控通路，发现PA5470, RsaL和核酸酶Orn，PNPase在细菌耐药中的作用；5.在研究了多个调控通路的基础上，发现HigB上调c-di-GMP降解酶，使胞内c-di-GMP水平下降，从而使T3SS基因表达水平升高。综上所述，本项目通过研究持留菌生理状态、细菌耐药机制、T3SS调控网络和HigB-HigA的作用机制阐明了HigB-HigA调控T3SS的机制，为深入了解持留菌生物学特性及清除持留菌提供了基础。