PARP1调控BRD7稳定性的机制及其在乳腺癌中的意义

Breast cancer is one of the most common malignant tumors with poor prognosis of women, and its pathogenesis still keeps unknown. Operation and chemotherapy are mainly comprehensive treatment for this disease. Our previous study indicated that E3 ligase APC/C complex is involved in the stability of tumor supressor gene BRD7, targeting the APC/C-BRD7 pathway can significantly inhibit the growth of tumor cells. The recent study found that PARP1 can interact with BRD7 and promote its degradation via poly ADP- ribosylation modification. These results suggested that PARP1 may function as an oncogene involved in tumorigenesis through negative regulation of BRD7. In this project, multiple methods, including immunofluorescence, Co-IP, In vivo ubiquitination assay, will be performed to further elucidate the molecular mechanism of BRD7 interaction with PARP1. In addition, we will explore the biological function of the APC/C-BRD7 pathway by performing in vivo and in vitro assay. Finally, we will detect the expression of PARP1 and BRD7 in breast cancer tissues and analyse its potential role in breast cancer development. Taken together, This study would help to further understand the mechanism of tumorigenesis and identify a novel potential target for dignosis and therapy in breast cancer.

乳腺癌是女性最常见、预后差的恶性肿瘤之一，主要以手术和化疗为主的综合治疗，但其发病机制仍然不明。我们前期研究发现：E3泛素连接酶APC/C复合物通过泛素化参与调控抑癌基因BRD7的蛋白稳定性，阻断APC/C-BRD7通路可显著抑制肿瘤细胞的生长。最近的预实验结果表明：多聚酶PARP1可与BRD7相互作用，促进其多聚ADP-核糖化修饰，负调控BRD7的蛋白稳定性。这些结果提示：PARP1可能通过负调控BRD7的蛋白稳定性参与到肿瘤的发生发展过程。本项目拟采用免疫荧光、免疫共沉淀（Co-IP）、体内泛素化等方法，进一步研究BRD7与PARP1相互作用的分子机制，通过体内与体外实验探讨PARP1-BRD7通路在乳腺癌中的功能，并结合临床乳腺癌标本，揭示PARP1与BRD7表达的相关性及在乳腺癌预后中的作用。本项目的开展将有助于阐明乳腺癌的发病机制，也可能为乳腺癌的诊断与靶向治疗提供新的思路。

乳腺癌是女性最常见、预后差的恶性肿瘤之一，主要以手术和化疗为主的综合治疗，但其发病机制仍然不明。我们前期研究发现：BRD7作为肿瘤抑制基因，其蛋白稳定性受到E3泛素连接酶APC/C复合物的调控，靶向抑制APC/C-BRD7通路可显著抑制肿瘤细胞的生长。在本次研究中，我们又发现了调控BRD7稳定性的新机制：DNA损伤的情况下，聚腺苷酸二磷酸核苷酸转移酶PARP1结合BRD7并促进其被PAR修饰，而BRD7的PAR修饰信号启动了招募E3泛素连接酶RNF146，从而增强BRD7的多聚泛素化修饰促进其进一步被26S蛋白酶体降解。具体来讲，首先我们发现：BRD7与PARP1在内源与外源水平均具有显著的相互作用，而且这种互作在DNA损伤的情况下会进一步增强；其次，PARP1与BRD7的互作促进了BRD7的PAR修饰，敲除内源性的PARP1，BRD7的PAR修饰几乎完全被抑制，而且BRD7的PAR修饰位点主要发生于613R/614K氨基酸位点；第三，PARP1与BRD7的互作影响了BRD7的蛋白稳定性，敲除或抑制PARP1后BRD7的蛋白水平显著上调，蛋白半衰期显著延长，泛素化修饰水平大大降低；第四，PARP1促进BRD7蛋白的降解主要通过E3泛素连接酶RNF146来完成。敲低RNF146后，BRD7蛋白的稳定性显著增强，泛素化水平降低；而且BRD7与RNF146的互作依赖于PARP1介导的PAR修饰，敲除PARP1后解除了RNF146与BRD7的结合。第五，RNF146作为E3泛素连接酶，具有典型的泛素连接酶的结构domain：RING domain，负责识别特异性的底物；WWE domain，负责识别被PAR修饰的蛋白，因此我们构建了一系列RNF146的缺失突变体， Co-IP实验证实：无论缺失RING domain还是WWE domain都将抑制其与BRD7的互作。反过来，我们也对BRD7负责结合RNF146的作用区段进行了鉴定，发现BRD7(1-128)区段对RNF146的结合不是必需的。最后，由于BRD7作为潜在的肿瘤抑制因子，其可以抑制细胞周期的G1-S的进程，促进细胞凋亡的发生。因此我们选用乳腺癌细胞系进行了验证，发现确实化疗药物(CPT/VP16)与PARP1抑制剂(Olaparib)联用效果显著优于单用化疗药物；但敲除内源性BRD7之后，则这种联用效果得到解除，