模块化微流控芯片上基于液滴数字化分析的高内涵病原测试

To overcome limitations associated with the microfluidic technologies for microbial pathogen testing such as the limited information throughput and quantitation precision, this project aims to expand testing content and improve quantitation precision by using the droplet digital assay. We plan to develop a modularized microfluidic chip to achieve multiplexed droplet digital assay by taking advantage of spatial resolution of the microchip. In the microfluidic system, digital nucleic acid amplification assay and digital bacterial viability testing are to be implemented simutaneously under the same contition. The proposed microfluidic assay is expected to achieve high-content microbial pathogen testing in shortened time, including the identification of multiple microbial pathogens and antimicrobial susceptibility testing with multiple agents. In this study, we select urine tract infection as the testing model. The analysis system is to be designed and constructed following the demand from clinical pratice. The content of the research work includes three parts: (1) the integration of functional elements in the digital assay unit; (2) the achievement of multiplexed assay in the same module; and (3) the combination of multiple analytical modules in the same system. We will perform systematic methodology evaluation by using the model samples and batched clinical samples, and the practical application value of the system is to be verified against the traditional method.The ultimate goal of the study is to develop this high-intension analysis into a universal pathogen testing technique, and to make a beneficial attempt to improve the diagnosis and treatment capacity of infectious diseases.

为突破现有微流控芯片病原检测技术存在的信息通量和定量精度方面的限制，申请人设想利用液滴数字化分析实现测试内容的拓展和测试精度的提高。研究计划发展一种模块化微流控芯片系统，实现基于空间分辨力的复合式多重液滴数字化分析。系统中数字化核酸扩增和数字化细菌活性测试在同一反应条件下同步运行，可在较短时间（<1h）内实现包括多重病原鉴定、定量以及多种药物敏感性测试的高内涵病原测试，在信息通量和定量精准性方面相对于现有病原检测技术具有的巨大提升。研究以尿路感染为模式研究对象，根据实际需求设计和构建分析系统，完成数字化分析单元内分析功能的集成、同一模块内多指标测试内容的集成以及同一系统内不同功能模块的集成。研究以模式样品和批量临床样本进行系统的方法学评价，并对照传统方法验证该系统的实际应用价值。研究的最终目标是将这种高内涵分析发展为普适性的病原检测手段，为提升感染性疾病诊疗能力做出有益的尝试。

针对微流控病原诊断技术面临的挑战，本课题面向高内涵感染性病原测试，分别发展了基于液滴数字化分析的核酸分析和抗生素敏感性测试模块。.（一）基于液滴数字化分析的核酸分析模块.研究设计和加工了一种微流控芯片，包含核酸提取、液滴发生和和液滴环介导等温扩增（LAMP）单元。.研究利用这种芯片进行了尿液中大肠杆菌定性和定量检测。结合磁珠操控和注射器真空驱动的流体控制，可以实现从样品输入到结果输出的整个过程。完成核酸扩增后，荧光显微镜观察芯片并呈像。计数扩增反应阳性液滴数和阴性液滴数，并利用数字化分析推算出样品中核酸靶标浓度。.本研究发展的集成式微流控芯片数字化等温扩增分析方法能够以“样品进-结果出”的方式完成大肠杆菌定性和定量检测。批量临床样品分析结果显示，这种方法与现有细菌检测方法一致率为100%。.（二）基于液滴数字化分析的抗生素敏感性测试模块. 研究利用微流控液滴技术将细菌分散于含有碳青霉烯抗生素和刃天青的油包水型液滴中，借助液滴的样品富集效应和数字化分析的精准定量能力来缩短分析时间。一方面，在液滴分散体系内，只有部分液滴包含细菌。由于液滴体积非常小，包裹细菌液滴中的细菌密度会高于原始样品。显色因子在微小体积液滴可以快速积累达到检测限，因而可缩短孵育时间；另一方面，数字化分析的定量精度极高，可以分辨细菌数量的微小变化。研究利用液滴显色分析计数刃天青显色反应阳性液滴数和阴性液滴数，并利用数字化分析推算出样品中核酸靶标浓度。