病原细菌外膜毒力因子三维结构和功能关系研究

Millions people are died for the reason of infectious diseases which are related to kinds of pathogenic bacteria every year. Human usually make use of kinds of antibiotics to handle these diseases in clinical remedy. Whereas, extensiveness use and undue dosage result in the increasingly serious antidrug phenomenon, and people have been determined more and more muti-antidrug pathogenic bacteria in clinical experiments. Consequently, people should accelerate to design new drug and (or) vaccine.The outer membrane virulence factors, directly participate in the colonization, adhension and invasion during the infectious pathway of pathogenic bacteria, are the potential targets of new kinds of antibacteria drug. Hence, we plan to determine the crystal structures of some key outer membrane virulence factors. On the basis of these determined structures, we will characterize the biochemical function of the factors, such as the enzymic activity, the protein-protein interaction, and explore the relation between the structure and biochemical functions. In addition, we will study the effects which virulence factor participate the virulence of pathogenic bacteria by animal models, and also probe the interference of the factor on the bcateria clonizing at the host organisms. Moreover, by the experiments of bacteria infecting host epithelial cells, we study whether the virulence factor relate to the adhering and /or invading tache.The results from these structural and functional experiments will provide some key basements to explore the molecualr mechanism of infectious process of pathogenious bacteria; and supplying the key structural models for developing new anti-bacteria drugs and vaccines. Therefore, the project has an important theoretical significance and a promising prospects.

全球每年因病原细菌感染而引起死亡的病人达数百万，抗生素的过度使用使病原细菌的临床耐药日益严重，导致上百种细菌临床耐药，特别是多重耐药在临床上更加难以控制。因此开发新的抗菌药物和治疗方案迫在眉睫。外膜毒力因子与病原细菌对宿主的定植、粘附、感染等过程密切相关，是极具潜力的新一代抗菌药物作用的靶蛋白质。课题拟应用蛋白质晶体学解析一些重要病原细菌外膜毒力因子的三维结构。基于获得的三维结构，测定其生化活性（酶活性、与宿主蛋白质的相互作用等），研究其结构与生化功能的关系；通过动物实验研究毒力因子与病原细菌毒力的关系，探讨其对病原细菌在宿主中的定植的影响；运用细胞实验研究毒力因子与病原细菌粘附、侵袭宿主上皮细胞的关系及其机制。通过上述研究，为深入认识病原细菌感染宿主的分子机制提供重要的实验基础，为基于毒力因子设计开发新一代抗菌药物和疫苗提供结构模型。课题的实施具有重要的理论意义和巨大的潜在应用价值。

全球每年因病原细菌感染而引起死亡的病人达数百万，抗生素的过度使用使病原细菌的临床耐药日益严重，导致上百种细菌临床耐药，特别是多重耐药在临床上更加难以控制。因此开发新的抗菌药物和治疗方案迫在眉睫。外膜毒力因子与病原细菌对宿主的定植、粘附、感染等过程密切相关，是极具潜力的新一代抗菌药物作用的靶蛋白质。课题拟应用蛋白质晶体学解析一些重要病原细菌外膜毒力因子的三维结构。前期工作中课题组研究发现，肺炎链球菌的一个体内诱导基因sp0987 编码的假想蛋白质 GHIP是一个潜在的毒力因子。生物信息学分析显示,其编码产物可能为肽聚糖水解酶，主要作用是降解细胞壁中 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间的 β-1,4-糖苷键，属于GH25 家族溶菌酶；通过克隆、表达、纯化、蛋白质晶体培养、衍射数据收集和蛋白质三维立体结构解析，首次成功解析 SP0987 的三维立体结构(PDB code 4FF5)；序列比对和三维结构叠合分析发现，GHIP是溶菌酶样蛋白质，保守性分析及结构特点分析发现可能的活性位点D33、D131、E133 和D222，且都为酸性氨基酸残基；分子筛实验提示，GHIP 在溶液中以单体形式存在；应用绿色荧光蛋白报告系统分析GHIP的细胞定位，结果发现 GHIP定位于细胞膜，与生物信息学分析结果一致；用LFH-PCR技术构建GHIP缺陷菌， 小鼠体内生存实验结果显示，GHIP缺陷后肺炎链球菌毒力明显减弱；体外细胞实验发现，GHIP 缺陷菌对宿主细胞的侵袭明显弱于野生菌，而对宿主细胞的粘附没有明显差异；体内定植实验发现，肺炎链球菌 D39 野生菌及缺陷菌经鼻腔感染后，缺陷菌入血时间明显较晚，且在 BALB/c 小鼠鼻咽部和肺部的细菌载量有明显差异，缺陷菌的细菌载量明显减少。肺炎链球菌新毒力因子GHIP的发现与鉴定，为深入认识病原细菌感染宿主的分子机制提供重要的实验基础，为基于毒力因子设计开发新一代抗菌药物和疫苗提供结构模型。课题的实施具有重要的理论意义和巨大的潜在应用价值。