肾近曲小管中legumain在肾缺血预适应中的抗凋亡机制研究

Ischemic preconditioning can tolerate longer ischemia after organ brief ischemia / reperfusion, and can protect the kidney from subsequent damage caused by persistent ischemia. Important mechanism of renal injury caused by ischemia-reperfusion is apoptosis.Legumain (asparagine endopeptidase enzyme) in the renal proximal tubule epithelial cell was found expression significantly. Our previous studies found that the donor kidney before transplantation warm ischemia period to appear stress high expression of Legumain, and proved that there was interaction between Legumain and TRAF6 protein. TRAF6-NFκB signaling pathway was related with anti-apoptosis. It is found that there was a kind of anti-apoptotic role for vascular endothelial cells and HEK293 cells with high expression Legumain. We speculate that there is the anti-apoptotic mechanism of Legumain in ischemic preconditioning. Legumain as a starting point, we will study the anti-apoptotic function of Legumain in renal proximal tubule cells in renal ischemic preconditioning, to build the model of ischemic preconditioning in vitro and to look for the Legumain anti-apoptotic signaling pathways in renal proximal tubule epithelial cells. By comparison in cell apoptosis changes, important apoptosis pathway protein expression and localization in the kidney of deficient mice, wild-type mice and Legumain transgenic mouse, the study is to be done on Legumain expression changes in renal ischemic preconditioning, anti-apoptotic effects and mechanism of action, and to lay the foundation for clinical application.

缺血预适应指脏器短暂缺血再灌注后能耐受更长时间缺血而免受损伤。缺血再灌注肾损伤的重要机制是细胞凋亡。Legumain 在肾近曲小管上皮细胞中明显表达。本课题前期研究发现预植肾热缺血期Legumain应激性高表达；Legumain与TRAF6蛋白存在相互作用；而TRAF6-NFκB信号通路与抗凋亡有关。人们发现血管内皮细胞和HEK293细胞中高表达Legumain可以抑制细胞凋亡作用。我们认为Legumain介导的抗凋亡作用可能参与缺血预适应过程。本项目拟以Legumain为出发点，模拟缺血预适应环境，寻找肾近曲小管上皮细胞中Legumain抗凋亡信号途径。建立小鼠肾缺血预适应模型，并通过对比Legumain缺陷型、野生型和Legumain转基因小鼠肾脏细胞凋亡变化、重要凋亡通路蛋白表达和定位情况等，研究Legumain在肾缺血预适应中的表达变化、抗凋亡作用以及作用机制，为临床应用奠定基础。

肾缺血再灌注损伤（IRI）是肾移植过程中造成肾脏损伤的重要原因，其重要机制是导致细胞凋亡。本课题通过观察移植肾各类不同病理损伤后，病理形态表现及Legumain表达评分和表达位置，发现Legumain在临床移植肾应激性反应，如急性排斥反应时，有一定升高，且主要在肾近曲小管上皮细胞（PTEC）中明显表达，故考虑Legumain在可能在此过程中可能起到一定作用。此外，缺血预适应指脏器短暂IRI后能耐受更长时间缺血而免受损伤，可以一定程度上保护肾脏。本课题首先建立小鼠IRI模型，模拟人体肾脏损伤过程，测定此过程中不同时间肾脏损伤程度，同时通过蛋白质生物化学、细胞生物学等方式测定Legumain在此过程中的变化，发现IRI后肾损伤的生化结果和病理评分随时间进行性加重，同时肾IRI损伤后PTEC免疫组化染色Legumain表达较对照组增加。通过建立PTEC缺血模型及小鼠IRI模型发现Legumain与肾缺血的时间关系，初步验证了Legumain对肾IRI损伤的保护作用。并建立缺血预适应模型（IPC），与IRI模型对比肌酐及尿素氮，发现IPC可以降低IRI损伤，并减缓随时间的进行性损伤。再通过生物信息学分析发现与Legumain相关的作用通路，如LAMC3、TRAF6等均通过NF-kB通路表达其作用。为进一步验证，通过采用ES细胞打靶的方式，对Legumain基因进行flox修饰，建立条件敲除Legumain基因小鼠及其IRI模型和缺血预适应模型。根据其肾损伤指标进一步确认了Legumain对肾脏的保护作用，并根据qPCR和Western blot的结果，Legumain在缺氧再灌注模型中，可能与细胞凋亡相关（如caspase-3和BCL2等），而与自噬可能并无关联性（如BECN1和LC3等），推测Legumain可能通过调控细胞凋亡过程，起到肾脏IRI损伤后作用。综合上述结果，本研究建立了小鼠IRI模型及IPC，并建立条件敲除Legumain基因小鼠及其IRI、IPC模型，为深入探讨Legumain对肾脏缺血再灌注及缺血预适应之间关系奠定了工作基础。同时，对Legumain保护肾IRI之间关系提供了线索。项目资助发表了核心论文3篇，待发表2篇。培养硕士生2名，1名已毕业，1名在读。项目投入经费70万元，各项支出基本与预算相符，剩余经费继续用于本项目研究后续支出。