新型RhoGTP酶调节蛋白FAM65B在中性粒细胞中的生物学功能及其分子机制研究

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells in mammals and form an essential part of the innate immune system. During the beginning phase of inflammation, particularly as a result of bacterial infection, neutrophils are one of the first-responders of inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They migrate through the blood vessels, then through interstitial tissue, following chemical signals such as fMLP in a process called chemotaxis. Rho GTPase RhoA plays key roles in cytoskeleton remodeling signaling in stimulating neutrophils. Through tandem affinity purification, mass spectrometry analysis and GST-pulldown methods, we demonstrated that FAM65B interacted with RhoA. Furthermore, FAM65B overexpression could suppress RhoA activity. We found FAM65B contained a RhoA-GTP binding domain which can compete with other RhoA effector such as PKN to bind to RhoA. To explore the physiological function of FAM65B, we generated FAM65B knockdown mice using shRNA lentivirus. The preliminary results showed that the chemotaxis was abnormal in FAM65B knockdown neutrophils. In this work, we will investigate the molecular mechanism and functional importance of FAM65B-mediated RhoA suppression in neutrophils.

当机体发生感染时，中性粒细胞能感知炎症部位释放的趋化信号，渗出血管，趋化运动到炎症部位，然后通过吞噬或释放杀菌物质，消灭病原微生物。整个过程涉及到细胞骨架的动态重排，其中 GTP酶 RhoA起了关键的调控作用。在前期工作中，我们鉴定了一个在免疫系统中特异表达的新基因FAM65B。FAM65B超表达可引起细胞骨架重排。通过亲和纯化、质谱鉴定和GST pulldown实验，我们发现FAM65B可以和RhoA相互作用，并显著抑制RhoA活性。FAM65B有一个结合活性RhoA的结构域，可以和PKN等RhoA效应蛋白竞争性结合RhoA。另外，我们还发现FAM65B削减表达小鼠的中性粒细胞的趋化运动等能力受损。在本项研究中，我们将详细探讨FAM65B对RhoA负调控的内在分子机制，阐明这种抑制作用在上游信号通路调控下的动态变化规律，并揭示FAM65B在中性粒细胞生理功能中的重要作用。

中性粒细胞是哺乳动物血液中白细胞的主要类群，当机体受到病原入侵，在炎症反应发生早期中性粒细胞是首先迁移到炎症部位对抗病原微生物的免疫细胞。它们感知炎症部位释放的趋化信号（如fMLP），渗出血管，迁移到炎症部位的整个过程称为趋化运动（chemotaxis），随后通过吞噬或释放杀菌物质，消灭病原微生物。而细胞极化（Polarization）是趋化运动的第一步。血液循环中未被激活的中性粒细胞是非极化的，只有接收到趋化信号才会极化。中性粒细胞极化的特征表现为F-actin呈片状聚集于中性粒细胞前端，而活性RhoA及其下游pMLC集中分布在细胞尾端，但RhoA活性和pMLC的定位是通过何种机制实现的，目前仍不十分清楚。本课题发现了一个新的RhoA调节蛋白FAM65B，它可与RhoA结合并抑制RhoA活性，并且其对于中性粒细胞极化有着至关重要的作用。通过实验，我们首次阐明了FAM65B调控RhoA活性的极性分布从而参与中性粒细胞极化过程的具体分子细节：中性粒细胞接收到外界趋化信号后，通过膜表面蛋白受体激活PLCb和PI3Kc信号通路，Akt、PKC等激酶磷酸化FAM65B，磷酸化FAM65B可与14-3-3家族成员结合，后者使其稳定性增强并定位于细胞前端，致使前端RhoA活性被抑制。而敲除了FAM65B的中性粒细胞接收趋化信号后前端RhoA活性异常增高，随之pMLC的定位也出现异常，细胞趋化运动方向发生紊乱。这些证据表明FAM65B在中性粒细胞极化中具有非常重要的生物学功能。