银杏古树维管形成层树龄相关miRNAs的发掘与功能分析

Ancient trees are important for landscape and germplasm. In particular, ancient Ginkgo biloba trees are widely distributed in China and could reach extremely long lifespan with thousands of years. However, little is known about the longevity mechanism of ancient Ginkgo trees. Here, on account of the cambial cells division and differentiation abilities, which are closely related to tree lifespan, we will take G. biloba cambium as experimental materials using cytological, molecular, genetics and bioinformatics ways, and focus on studies as follows: (1) We will observe the cytological characteristics, and analyze physiological traits in cambium of G. biloba within different ages. (2) We will sequence the transcriptome and miRNAs, combining with the analysis of degradome to identify candidate miRNAs and their target genes which related to age. (3) We will further separate and identify the functions of candidate genes to reveal key genes associated with age. The expected outputs will unravel the important age-related differences in vascular cambium at the cytological, physiological, molecular and genetic levels, and will provide valuable reference for the age-related molecular mechanism of cambium in G. biloba.

古树是重要的植物景观和种质资源，其中银杏古树在我国分布广泛，且寿命可达上千年。然而，银杏古树的长寿机制却不清楚。本项目以银杏古树为主要研究对象，针对与树木寿命密切相关的形成层干细胞分裂和分化能力，采用细胞学、分子生物学、遗传学和生物信息学等实验技术，着重开展三方面研究：(1) 不同树龄维管形成层的细胞学观察及激素等生理指标分析，探明银杏古树维管形成层细胞的生理特性；(2) 不同树龄维管形成层miRNA和转录组测序比较研究，并结合降解组学分析，筛选出与树龄相关的候选miRNA及其靶基因；(3) 对候选基因进行分离与功能验证，探明银杏古树维管形成层与树龄相关的重要miRNAs及其靶基因。本项目从细胞学、生理学、分子生物学和遗传学这4个层面揭示维管形成层不同树龄之间差异，为阐释银杏维管形成层树龄效应相关的分子机理提供依据。

古树寿命可达上千年，然而其长寿机制却不清楚。本项目以银杏古树为主要研究对象，以20年、200年和600年左右树龄的银杏维管形成层细胞为实验材料，通过形态观察、细胞学、转录组学、小RNA及降解组学测序技术开展了以下研究:（1）对形成层活动年周期进行了划分，12月至2月上旬为休眠期，2月中旬至4月为恢复活动期；4月下旬至10月为活跃期，11月为过渡期。形成层层数在活跃期最多，休眠期最少。（2）在年周期研究基础上，选取5月份不同树龄的树进行取样。通过年轮测定技术结合胸径分析，确定了34株银杏树的真实树龄，分布在15年-1353年，并将其中不同树龄的树木分为三组进行比较研究，发现古树组(193-667年)形成层细胞层数变少，新产生年轮宽度变窄，而古树树干的横截面积增加量 (BAI)仍处于高水平；生长素(IAA)含量下降，脱落酸(ABA)含量上升，H2O2含量在古树中高于20年，POD及SOD活性在20年组中最高。（3） 古树细胞分裂分化相关基因表达显著下降，尤其miR166靶向HD-ZIP III家族基因，miR166表达量随树龄的增加而升高，HD-ZIP III家族基因则表现出相反的表达模式，降解组测序明确了miR166对6个靶基因的切割位点。这些结果表明古树形成层细胞的分裂能力下降。此外，银杏古树维管形成层细胞中，鉴定到457个R基因，数量远多于其他植物。此外，木质素单体(monolignol)、类黄酮(flavonoid)和芪类化合物(stilbene)代谢通路的基因数量和表达在古树组中也没有下降，表明古树抗性强。古树叶片光合指标、种子繁殖能力、衰老相关的标记基因(marker genes)和miRNA及靶基因和自噬相关基因等，均未发现有显著变化。（4）对筛选出的重要基因，包括细胞分裂分化、衰老和抗性相关基因在更多年龄银杏植株、叶片衰老过程进行验证，并进行了进化树分析，进一步验证了这些基因功能。上述研究结果从形态学、细胞学、转录组学、小RNA组学和降解组学层面揭示了银杏古树长寿机制，主要结果发表在PNAS上，被Science和Nature报道和评述。