解析蕨类植物叶绿体基因组高变区的进化式样、过程和机制

On the basis of our recently published work (BMC Evolutionary Biology 2009, 9: 130; BMC Plant Biology 2011, 11: 64), this project proposes to further explore the evolutionary pattern, process, and mechanism of four hypermutable regions (rpoB-psbZ, trnG-trnT, psbA-ndhBex1, and trnR-ycf2) in the fern chloroplast genomes. The regions will be amplified by using long-range PCR and then sequenced following the primer walking strategy. Five specific questions will be investigated: (1) What are the effects of frequent structural variations on the adaptive evolution and co-evolution patterns of chloroplast protein-coding genes? (2) Does localized increase in the rate of nucleotide substitution contribute to the occurrence of gene loss, gene rearrangement, and extensive length variations found in the intergenic regions? (3) Why do inversions tend to occur in pairs (inversions are often followed by a reinversion)? In particular, what roles do the propensity of adjacent genes to be located on the same strand (sideness) and the clustering of functionally related genes play in the inversion-reinversion process? (4) Why are the trnY-trnE intergenic spacers dramatically expanded in hymenophylloids and equisetoids? This subproject will focus on revealing the base compositions and the secondary structure features of repeated sequences as well as their expansion processes and mechanisms. And (5) Are there any chloroplast DNA inversions evolved by convergence/parallelism within the phylogenetic framework of ferns? These studies will unravel novel insights into the evolutionary dynamics of fern chloroplast genomes.

在我们已有的工作基础上，提出对蕨类植物叶绿体基因组的rpoB-psbZ、trnG-trnT、psbA-ndhBex1及trnR-ycf2等高变区，采用长距离PCR和步移测序相结合的策略测定其序列，并进而研究高变区的进化式样、过程和机制。研究内容主要包括：（1）剖析高水平结构变异对蛋白编码基因的适应性进化和共进化式样产生的效应；（2）探究基因丢失、基因重排和基因间隔区的长度变异是否同局部序列的进化速率增快有关；（3）研究位于高变区的倒位为何倾向于成对出现（发生倒位-再倒位），重点揭示基因的同侧性和成簇分布所起的作用；（4）分析导致膜蕨类和木贼类trnY-trnE基因间隔区急剧扩张的原因，阐明区内所含重复序列的核苷酸组成与二级结构特征，认识重复序列的扩张过程和机制；（5）在蕨类植物的系统发育框架下，明确是否有叶绿体DNA倒位发生过趋同和平行演化。这些研究对理解叶绿体基因组的进化动态具重要意义。

本项目对蕨类植物叶绿体基因组高变区的进化式样、过程和机制进行了解析。已经完成以下研究内容并获得重要结果：首先，采用高通量测序的方法测定了瓶蕨、七指蕨、薄叶阴地蕨、北京铁角蕨、笔筒树和黑桫椤等蕨类植物的叶绿体基因组全序列，报道了这些基因组的一般特征，并提取了高变区的序列。对于其他蕨类植物叶绿体的高变区则借助长距离PCR和步移测序相结合的途径测定了其序列。这为研究蕨类植物叶绿体基因组的进化提供了必需的数据资源。第二，揭示了影响蕨类植物叶绿体基因组高变区进化的一些关键因素和机制。发现序列上下文同碱基替换、插入/缺失、序列重复的产生以及进化速率的改变存在较强关联。在叶绿体基因的核苷酸替换速率上，树蕨类和非树蕨类之间表现出显著差异。前者有1个基因的非同义替换率（dN）和7个基因的同义替换率（dS）显著小于后者；而有17个基因的dN/dS比值显著大于后者。这些结果提示，“有丝分裂速率”假说在薄囊蕨类并不完全成立。第三，深化了对蕨类植物叶绿体基因组的进化动态的理解。发现叶绿体tRNA基因的容量从基部蕨类到核心薄囊蕨类呈现减少的趋势。瓶蕨、里白和海金沙拥有全部86个见于蕨类植物叶绿体基因组的蛋白质编码基因，而其他已测序的蕨类叶绿体基因组则会丢失1至5个基因。在铁芒箕叶绿体DNA反向重复区和大单拷贝区的连接处鉴定出一个倒位（位于trnL-CAA和trnV-GCA之间），推测这是里白科或里白类共有的一个特征。另外，还注意到基因丢失、基因重排以及基因间隔区的长度变异和所在及邻近序列的进化速率增快有关。基因的同侧性和成簇分布是引发高变区出现倒位—再倒位现象的重要原因。第四，利用叶绿体基因组全序列、串联的叶绿体基因序列数据以及叶绿体DNA重排数据，重建了蕨类植物的系统发育，并且证实有部分叶绿体DNA倒位发生过趋同和平行演化。项目的研究结果发表在Molecular Phylogenetics and Evolution、Frontiers in Plant Science、Mitochondrial DNA、Biochemical Systematics and Ecology及Archives of Biological Sciences等重要SCI国际学术刊物，被国内外其他研究组多次引用。