短蛸清道夫受体的多样性及其介导的免疫防御机制研究

As an important pattern recognition receptor in the innate immune system, scavenger receptors (SRs) can recognize and bind various non-self molecules, mediate phagocytosis, and play crucial roles in pathogen recognition and elimination. In present project, techniques in bioinformatics, molecular biology and immunology will be used to (1) clone the full-length cDNA of SRs from Octopus ocellatus, and analyze their phylogenetic relationship; (2) detect their expression patterns, both in tissues and towards stimulation of microorganisms or pathogen-associated molecular patterns (PAMPs); (3) recombine these SRs, analysis their binding ability to microorganisms or PAMPs; (4) produce polyclonal antibodies against SRs, investigate hemocyte phagocytosis mediated by SRs; (5) silence the expression of SRs in vivo, and unveil their roles in immune defense against pathogens. This project will provide evidence for understanding the molecular basis of the SRs diversity and confirming their immune defense functions. Meanwhile, it will further reveal the mechanism of the cephalopod innate immunity and shed new light on the immunology of marine invertebrate.

清道夫受体（Scavenger receptors，SRs）能够识别和结合多种"非己"成分并介导细胞吞噬，作为先天性免疫中重要的模式识别受体，在病原识别和清除过程中发挥重要作用。本项目拟采用生物信息学、分子生物学和免疫学技术，从短蛸中克隆多种SRs基因，对比分析各SRs基因的序列和进化特征；检测各SRs在组织中的表达模式，及短蛸受到微生物或PAMPs刺激后的调控规律；体外重组各SRs，分析表达产物与微生物或PAMPs的结合活性；制备抗SRs多抗，抗体抑制实验探讨各SRs介导的细胞吞噬功能；沉默各SRs在体内的表达，明确其在短蛸抵御病原微生物侵袭中的作用。该项目将系统了解短蛸SRs多样性的分子基础，确定各SRs的免疫防御功能和分工，为进一步揭示头足类动物先天性免疫的分子机制，丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学的内容提供理论支持。

清道夫受体（scavenger receptors，SRs）是一类模式识别受体，具有广泛的配体识别谱，在病原识别和清除等过程中发挥重要作用。哺乳动物SRs研究透彻，已知SRs根据其结构特征分为8类。. 本项目克隆了多种短蛸SRs，分析了其中5种SRs的序列特点和系统进化特征；利用荧光定量PCR检测了5种SRs在健康短蛸各个组织和受到细菌刺激后血细胞中的表达规律；对B型和I型的SRs进行了重组，并利用纯化的重组蛋白制备了多抗；以免疫学方法分析了SRs重组蛋白的配体结合活性，在短蛸血细胞上定位了SRs编码蛋白，分析了SRs重组蛋白对短蛸血细胞吞噬的影响；利用siRNA干扰了短蛸活体SRs的表达。. 经过Blast搜索、结构域分析、多序列比对、三维结构预测和系统进化分析，证实克隆获得的5种SRs具有SR基因序列特点，其中OoSR-B和OoSR-I分属于B型和I型SR家族成员。各SRs的mRNA在健康短蛸各组织中都有表达，其中OoSR-B和OoSR-I分别在肝胰腺或血细胞中的表达量最高；在短蛸受到细菌刺激后，血细胞中各SRs的mRNA以不同模式上调，暗示各SRs可能通过不同方式参与抵御细菌的免疫反应过程。在钙离子存在的条件下，OoSR-B和OoSR-I的重组蛋白可以结合包括乙酰化低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、天然低密度脂蛋白、脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖、酵母聚糖和葡聚糖在内的多种检测配体；为其作为模式识别受体识别和结合外源微生物提供了条件。间接免疫荧光染色和细胞吞噬实验发现OoSR-B编码蛋白位于短蛸血细胞上，并能体外介导血细胞对于大肠杆菌和藤黄微球菌的吞噬作用，而OoSR-I编码蛋白不存在于血细胞上，对血细胞吞噬无显著影响；证明了OoSR-B和OoSR-I在短蛸免疫防御过程中表现出功能差异。利用半定量PCR和荧光定量PCR检测发现，siRNA活体干扰后OoSR-B或OoSR-I的表达量显著降低，进一步确认了OoSR-B和OoSR-I基因的功能。. 本项目确定了多种SRs的基因特征和进化特点，分析了不同类型SRs的功能差异，阐释了各种SRs在短蛸免疫防御中的作用方式和分子基础，研究结果对于深入了解海洋无脊椎动物免疫防御机制，指导短蛸病害防控和良种培育具有重要意义。