利用拟南芥模式系统研究尿苷化参与miRNA稳定性调节的分子机制

miRNAs are key regulators of plant and animal development and their steady-state levels are fine controlled at both the transcriptional and posttranscriptional levels, including transcription, biogenesis and stability. Although the miRNA biogenesis pathway has been extensively investigated during the past decade, little is known about miRNA stability control. Our recent study showed that HESO1 and URT1 are terminal uridyl transferases that can uridylate unmethylated miRNAs to trigger their degradation. However, how uridylation triggers miRNA degradation is unclear. In addition, enzymes catalyzing miRNA truncation and degradation remain to be identified. In this proposal, we plan to employ various biochemical and molecular biological approaches to study how HESO1 and URT1 coordinate with each other in catalyzing miRNA uridylation and their roles in miRNA degradation. Moreover, taking the advantage of available rich genetic resource, this research also aims to identify novel enzymes that are responsible for miRNA truncation or degradation, which is critical for understanding the biological significance of the co-occurrence of uridylation and truncation, and their mechanistic roles in miRNA degradation. In conclusion, this research will expand our understanding on small RNA stability control and benefits our utilization of various small RNA based technology (e.g. artificial miRNA and RNAi) in fine-tuning of gene expression.

miRNA是动植物生长发育的重要调控因子，其表达水平受到转录、加工和稳定性等多个层面的精细调控。过去十几年的探索使我们对miRNA的生物合成途径有了深入的了解，但是关于miRNA稳定性的研究才刚刚起步。申请人前期工作表明HESO1和URT1可以共同催化miRNA 3'末端尿苷化以促进miRNA降解，但是其作用机制尚不清楚。另外，参与miRNA截短和降解的酶也有待发现。本项目拟采用多种生物化学和分子生物学方法，进一步研究HESO1和URT1协同催化miRNA尿苷化的分子机理，尤其是在底物识别和酶促动力学上的异同；同时充分利用已有的遗传资源找寻参与miRNA截短和降解的酶基因以及探讨miRNA尿苷化和截短在miRNA稳定性调节中的关系，力图阐明两种不同修饰共存的生物学意义。本研究将拓展我们对小分子RNA稳定性调控的认识，同时为我们更好的利用小分子RNA实现细胞内基因表达精细调控奠定理论基础。

HEN1介导的miRNA 3’末端甲基化(2-O-Me)是植物miRNA稳定性的一个核心保护机制。非甲基化的 miRNA 3’末端被大量的尿苷化加尾或截短修饰，导致其失稳降解。本研究通过正向遗传性筛选分离鉴定了一个新的尿苷化酶URT1参与miRNA的3’末端加尾，并在此基础上系统的开展了URT1与其同源蛋白HESO1协同催化miRNA尿苷化的分子机制研究。RNA-seq 数据库分析表明URT1表达量在各个器官中均较HESO1高，但是突变体遗传分析表明HESO1是HESO1是参与miRNA尿苷化的主效酶，在HESO1功能正常的情况下，urt1不能回复hen1的发育表型，仅影响少数miRNA的分子表型。类似的，过表达HESO1而非URT1可以加速miRNA降解及加剧hen1的发育表型。URT1在HESO1缺失情况下存在补偿效应，在HEN1功能正常时HESO1和URT1对部分非甲基化的miRNA存在类似的协同调控机制。体外酶活实验表明URT1编码一个非典型末端尿苷转移酶，HESO1和URT1均对UTP亲和力最高，但又有不同。尤其值得注意的是URT1在以腺苷或胞苷为底物时仍有一定活力且较HESO1强，这与体内存在一定量的C/A加尾相一致。与HESO1同时存在于核质不同，我们发现URT1只存在于细胞质中。HESO1和URT1在细胞质中共定位，且均与AGO1互作。小分子RNA测序结果表明HESO1可同时作用于全部miRNA与siRNA，而URT1主要作用于miRNA和一部分ta-siRNA，对hc-siRNA 没有影响，此外还发现尿苷化与截短存在相互竞争。通过进一步的正向遗传学筛选，我们分离鉴定了6个新的HESO1等位突变，1个新的URT1等位突变以及1个TCP4的突变体可以回复hen1的表型，此外还有一个hen1回复突变定位到第一条染色体前端。通过本项目的开展，明确了HESO1和URT1的协同工作机制及其底物选择的相同性和特异性，揭示了小分子RNA末端修饰的复杂性，拓展了人们对小分子RNA 稳定性调控的认识，也为最终建立一条相对完整的miRNA降解代谢途径奠定了基础。在本项目的资助下，共发表SCI论文3篇，应邀撰写方法学书章1篇。