烟草依赖RNA 的RNA 聚合酶I(NtRDR1)抑制抗病基因沉默的机理研究

在植物中依赖RNA的RNA 聚合酶1(RNA-dependent RNA polymerase1，RDR1)受病毒侵染和SA处理诱导，具有抗病毒作用；RDR6则通过参与病毒诱导的基因沉默起到抗病毒作用。在一种本明烟(Nicotiana benthamiana)烟草中，RDR1基因含有一个72碱基的插入导致功能缺失(NbRDR1m)。我们在本明烟中高表达和NbRDR1m 高度同源的普通烟RDR1(NtRDR1)，发现:NtRDR1转基因植物和RDR6被沉默(RDR6i)植物相似，对一些病毒更加敏感；进一步研究发现NtRDR1能抑制依赖RDR6产生的siRNA的沉默活性，而拟南芥RDR1（AtRDR1）则没有沉默抑制效应（PLANT CELL,2010）。本项目旨在深入探究NtRDR1抑制基因沉默的机制；结合对AtRDR1的功能比较研究，探究不同植物RDR1在植物生长发育和抗病途径的功能分化。

基于我们前期研究的发现：NtRDR1抑制RNA沉默作用但不抑制依赖RDR6的siRNAs 的产生，和RNA沉默途径，我们推测NtRDR1作用在siRNAs产生的下游，可能通过结合siRNA，或通过结合AGO蛋白，或抑制siRNA-AGO复合体对靶基因的剪切作用等方式抑制基因沉默。所以本项目的主要研究工作包括：在NtRDR1转基因烟草和拟南芥中，通过CO-IP实验，特异沉淀NtRDR1蛋白，检测NtRDR1与植物内源小RNAs以及AGOs的结合情况，但是实验过程中发现转基因植物中NtRDR1蛋白表达量很低，难以纯化。同时我们构建NtRDR1原核表达载体，希望获得NtRDR1蛋白，体外检测NtRDR1的结合siRNA及与AGOs互作情况，很遗憾的是我们尝试了多种表达条件后，发现NtRDR1主要在包涵体中表达，表达量非常低，难于获得纯化蛋白。不过有趣的是，我们发现在NtRDR1转基因拟南芥中ta-siR255的靶标基因At5G18040的RNA积累水平明显低于野生型，这和我们之前发现的在NtRDR1转基因烟草中syn-tasiRNA靶标基因GFP的积累量明显提高（Ying et al.,2010，Plant Cell）有所不同。我们的结果提示NtRDR1在参与植物沉默内源基因和外源基因的不同作用。相关研究工作仍在进行。另外，我们正利用最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9技术敲除普通烟中的NtRDR1基因，获得转基因植物后将直接研究NtRDR1在植物生长发育和抗病途径的功能分化。. 因研究需要构建小RNAs库；并应邀参与编写分子生物学实验方法一章节-基因沉默核心组分小RNAs的克隆方法。