肝移植后供肝内再循环淋巴细胞的动态解析

很多肝脏病变比如原发性胆汁性肝硬化、慢性丙型肝炎、肝移植后、供体抗宿主疾病等，均发现了门脉区域特异性淋巴细胞的高密度聚集。但肝脏内再循环淋巴细胞的动态及相关分子机制，国内外相关报道却很少。申请人证实了常态下再循环淋巴细胞在肝内最短循环时间为3-4小时；首次提出再循环淋巴细胞能够直接穿过门脉壁游走的理论；并揭示其分子机制。本研究将大鼠胸导管引流术，大鼠肝移植模型制作，光镜电镜观察，流式细胞仪技术，RT-PCR及定量PCR等实验方法有机结合，将再循环淋巴细胞的动态解析变为可能。对生理常态大鼠、肝移植大鼠以及分别接受供受体再循环淋巴细胞注射后的移植大鼠等实验组进行对比，统计肝内各领域据时间推移各类再循环淋巴细胞分布状况，对比粘附分子及趋化因子表达差异，找到关键粘附分子和趋化因子，从而揭示再循环淋巴细胞在移植肝内的动态。该研究对进一步揭示肝脏免疫耐受的分子机制、设计合理的肝移植后药物具有重要意义。

很多肝脏病变比如原发性胆汁性肝硬化、慢性丙型肝炎、肝移植后、供体抗宿主疾病等，均发现了门脉区域特异性淋巴细胞的高密度聚集。但肝脏内再循环淋巴细胞的动态及相关分子机制，国内外相关报道却很少。申请人通过本研究，成功建立了大鼠胸导管引流模型及大鼠肝移植模型并总结了相关手技和心得。对注射同种大鼠胸导管引流液中提取的再循环淋巴细胞的大鼠肝脏门脉领域以及肝移植后大鼠肝脏门脉领域的供体T细胞进行染色并计数,发现注射再循环淋巴细胞大鼠门脉领域内的供体T细胞在6小时后达到高峰并稳定于一定数值，而肝移植后大鼠肝脏门脉领域的T细胞随术后时间的延长而增加，并且大量增殖。发现随时间延长，与门脉内外壁接触的供体细胞逐渐增多，这个发现验证了供体细胞借门静脉通路游走的可能性。对生理常态大鼠及异种肝移植后大鼠肝脏组织进行粘附分子ICAM1、VCAM1、E-selectin、P-selectin、Selectin ligands、LFA1α、LFA1β、LFA2、Mac1等的染色并进行对比，发现其中ICAM1、VCAM1、Selectin ligands等的表达在两组间有显著差异。其他粘附分子的表达无显著差异。通过Type IV Collagen + BrdU + His41三重免疫染色法，发现大鼠肝移植后第4天，大量受体淋巴细胞聚集于供肝脉管区并增殖。进而选取该时间点标本，通过电镜照片直接找到了再循环淋巴细胞的一种新游走路径，证明了：再循环淋巴细胞能够直接穿过门静脉内皮细胞游走，与生理状态相比这种游走途径没有太大改变，不同的是游走速度以及流量。对肝移植后，注射供体或受体大鼠胸导管淋巴细胞能否改变大鼠生存率进行了考察，发现大鼠生存率无明显变化。用流式细胞术检测浸润淋巴细胞的CD4、CD8以及NK1.1的表达，发现异种大鼠肝移植后，供肝内CD4+Tcell出现大量增殖，相比于同种大鼠肝移植，这种增殖有明显差异。而在同种肝移植，异种肝移植，对照组三组间，CD4/CD8比例及NK1.1的表达在三组间未见明显差异。RT-PCR法检测趋化因子配体CXCL16及受体CXCR6mRNA的表达在肝移植后明显升高，且二者的表达具有明显的相关性。