M. globosa Lipase催化合成甘油二酯的分子机制研究

Diacylglycerols are widely recognized as a new kind of functional oils for its potential health benefits such as inhibiting the increase of the blood triglyceride, reducing the accumulation of body and visceral fats, preventing cardiovascular disease and diabetes mellitus. Lipase-catalyzed oil modification provides an efficient approach to synthesize diacylglycerols. Enzyme is crucial to catalytic conversion, and is the basis of the original innovations of industrial catalysis. Therefore, further exploration and evaluation of enzymes from different sources will always be required and be of significant. Lipase from Malassezia globosa is a novel lipase with high substrate specificity. In this project,.Malassezia globosa lipase is employed to synthesize diacylglycrols and its characteristics in the reaction process was investigated. Computational biology approaches, such as molecular docking and MD/MM, is utilized to analyze the three - dimensional structure of lipase and show the possible key amino acids. Lipase mutants are produced by site-directed mutagenesis and their catalytic characteristics are investigated in the production of diacylglycerols. Catalytic mechanism will be disclosed by analyzing catalytic parameters and three-dimensional structure. The research is of significant for the basic research of enzyme engineering, and will push the innovative proceeding of oil industrial catalysis.

甘油二酯是新型功能性油脂，具有降血脂、防止肥胖、预防心血管和糖尿病发生的重要功能。酶法改性油脂是制备甘油二酯的有效手段。酶是催化转化技术的核心，是实现工业催化源头创新的根本。因此，“不断发现新型酶并对其催化机制进行研究”具有重要的科学意义与应用研究价值。M. globosa Lipase是一类新型脂肪酶，具有特殊的底物特异性。本研究拟选取M. globosa Lipase 为研究对象，以合成甘油二酯为目标，重点研究其在甘油二酯合成反应中的催化特性；并采用分子对接，分子动力学等生物计算手段对酶的空间结构进行分析，挖掘催化特性与酶分子活性氨基酸变化的相关性；对酶分子中的活性氨基酸进行突变，并研究突变酶在甘油二酯合成反应中的酶学催化特性，对以上建立的脂肪酶的结构和功能关系进行检验和修正，以揭示酶分子的催化反应机制。通过本研究，可推动酶分子基础学科研究，并推动甘油二酯生产的源头创新。

本课题在前期研究的基础上，对Lipase SMG1的结构和功能关系与其在甘油二酯合成中的应进行了系统研究。首先进行了Lipase SMG1的重组表达与性质研究，利用毕赤酵母表达Lipase SMG1，通过发酵条件优化、蛋白纯化和酶学性质测定，完成了对Lipase SMG1表达系统的建立和野生型酶学性质的考察；然后开展了Lipase SMG1的晶体学研究，并与同源的甘油三酯脂肪酶进行了结构对比，初步阐明了其甘油酯底物特异性与酶蛋白结构的关系；考察了Lipase SMG1在合成甘油二酯中的应用，探讨了酶加量、脂肪酸和甘油的摩尔比和酯化反应温度对酯化反应的影响，并对催化该反应的动力学试验进行了研究，为利用偏甘油酯脂肪酶合成甘油二酯提供科学依据；通过对Lipase SMG1晶体结构的分析，特异性地对W116、W229和N277三位点进行定点突变，分析并比较野生型及突变体的酶学性质，结果显示突变后SMG1脂肪酶的酶学性质有了较大的变化对其甘油酯底物特异性没有显著影响；进一步以位于催化口袋边缘的Phe278，和盖子结构上的Leu103和Phe104位点为目标设计了L103G , F104G , F278A , L103G-F278A ,F104G-F278A以及Delete(103-104)突变体，结果表明所有的突变体仍然不能水解甘油三酯，但是一些突变体的底物选择性特别是甘油二酯底物异构体的选择性发生了明显变化；对Lipase SMG1的278位和102位氨基酸进行定点突变，考察酶学性质和晶体结构，结果发现通过单点突变（F278N或F278T），可以设计出高于野生型SMG1活性6倍的突变体；并对活力较高的Lipase SMG1-278N在油脂加工中的应用进行了考察，发现其在甘油二酯制备和高酸价动植物油脂酶法脱酸精炼中均有良好的应用效果。