拟南芥ACT2基因在气孔运动中的作用及其编码蛋白中影响微丝组装的关键氨基酸的鉴定

Actin is essential for a wide range of cullular processes in plants, inculding establishing and maintaining cell polarity,cytoplasmic streaming,organelle movement and pollen germination.Arabidopsis thaliana contains eight actin genes, ACT2 is one of three vegetative actins.So far,its functional competence for root development is thoroughly studied, but little is known about the role in another vegetative tissue-leaf. On the other hand,although more and more evidence confirms that actin filaments(F-actins)in guard cells are crucial for stomatal movement,the basic molecular mechanism remains unclear.To gain insight into the functional significance of ACT2 in stomatal movement,in this study, act2 mutant、GFP-actin binding domain 2(GFP-ABD2) and act2 point mutant(G160A) would be used. With the aids of several biological techniques,such as stomatal aperture analysis, confocal laser scanning microscopy,and point mutation,we try to revealthe role of ACT2 in stomatal movement， and highlight its potential contributions to the regulatory mechanism of stomatal movement.

微丝骨架对于植物诸多生命活动至关重要，如细胞极性的建立和维持、胞质环流、细胞器运动、花粉管萌发等。拟南芥共含有八个肌动蛋白基因，ACT2是其中三个编码营养器官肌动蛋白基因(vegetative actin genes)之一。目前，植物中对ACT2的认知多集中在根的生长发育上，而作为另一大主要营养器官-成熟叶片中的功能研究尚未见报道。另一方面，虽然微丝骨架在气孔运动中的作用已得到越来越多的实验证明，但其动态变化的基本分子机制仍待进一步阐明。本课题拟从以上两点入手，以拟南芥act2突变体(T-DNA插入)、GFP-ABD2及构建点突变体act2(G160A)等为材料，采用气孔开度药理学检测、激光共聚焦扫描显微镜亚细胞结构观察以及定点突变等细胞生物学、分子生物学技术手段，从不同层面、不同角度具体研究ACT2基因在气孔运动中的作用，为全面了解ACT2的生理功能，完善气孔运动机理提供新的线索。

微丝骨架(又称肌动蛋白纤维，F-actins)在植物生命活动中承担众多生理功能，如细胞极性的建立和维持、胞质环流、、花粉管萌发等。拟南芥中共含有8个肌动蛋白基因，ACT2是其中三个编码营养器官肌动蛋白的基因(vegetative actin genes)之一。目前，植物中对ACT2的认知多集中在根的生长发育上，而作为另一大主要营养器官-成熟叶片中的功能研究尚未见报道。此外，虽然微丝在植物气孔运动中的作用已得到越来越多的实验证明，但其动态变化的基本分子机制仍待进一步阐明。本课题拟从以上问题入手，以拟南芥act2突变体(T-DNA插入)、GFP-ABD2(actin-binding-domain2)及构建点突变体act2(G160A)等为材料，采用气孔开度药理学检测、激光共聚焦扫描显微镜亚细胞结构观察以及定点突变等细胞生物学、分子生物学技术手段，从不同层面、不同角度具体研究ACT2基因在气孔运动中的作用，为全面了解ACT2的生理功能，完善气孔运动机理提供新的线索。两年的时间里，根据计划书所列研究内容，取得了以下实验结果：1)气孔开度实验发现，act2突变对NO诱导的气孔关闭有显著的促进作用，仅30min突变体的气孔开度比对照还要小25%。用微丝稳定剂JAS和NO共同处理发现，JAS削弱了act2突变体促进NO气孔关闭作用。即微丝特异性稳定剂JAS可以在一定程度上恢复act2突变对气孔开度的影响。2)激光共聚焦扫描显微镜观察发现，在NO诱导的气孔关闭过程中，act2突变体保卫细胞的微丝比野生型解聚得更加剧烈，其中微丝完全解聚的IV型排布比例高达51%，远远高于野生型(35%)，差异显著，具有统计学意义。3)获得控制actin-ATP/ADP交换的关键氨基酸位点的定点突变体(G160A)，气孔开度检测发现，NO处理120min，点突变的气孔相对开度远远小于野生型，与act2突变体表现接近。同样根的表现上，正常培养7天，点突变的平均生长速率也小于野生型，总体表型介于野生型与act2突变体之间，显示本实验中关键氨基酸的预测是科学、有效的。以上研究有助于阐明ACT2参与气孔运动中微丝骨架动态转换的生理功能，为提高植物抗旱性与节水农业提供可靠的理论依据。