大豆慢生型根瘤菌多重耐药外排泵与根际竞争性结瘤的耦合关系研究

Legume-rhizobia symbiosis, as the mostly efficient system of biology nitrogen fixation (BNF), is vital not only for global nitrogen cycles, but also for agricultural practices. Although the researches to nodule development and nitrogen-fixing processes have been profoundly conducted on the molecular level, little is known about the nodulation competitiveness in rhizosphere. This research program will focus on the hypothsis that there exist the coupling relationship between one novel Bradyrhizobium japonicum multidrug efflux pump genes,which showed distictive response to isoflavonoid genistein, and its nodulation competitiveness in rhizophere. To address this scientific issue, the genetic structure of multdrug efflux pump, its respone to enviromental factors and genome-wide expression profiling as well as the effect on rhizosphere micorobe diveristy will be analyzed by using the tools of genomics, physiology, biochemical and rhizosphere microbe ecology. The results will further deepen our understanding of the roles of Bradyrhizbium japonicum in the soybean-Bradyrhizobium symbiosis. The research will provide scientific theory to enhance the nodulation competitiveness of rhizobia with superior genetic-trait of nitrogen-fixing, leading to the increasing of the nitrogen nutrition of plant, the improvement of the soil nitrogen status as well as the promotion of the plant growth.

豆科植物-根瘤菌共生固氮是生物固氮中效率最高的体系，无论对全球氮生态循环还是农业都极为重要。尽管根瘤发育与固氮反应过程在分子水平得到了深入研究，但是根际竞争性结瘤研究却进展缓慢。本项目以大豆慢生型根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum USDA 110）为研究对象，一处新发现的对大豆异黄酮具有明显应答特征的多重耐药外排泵(multidrug efflux pump)基因为切入点，并提出其是参与根际竞争性结瘤的关键基因假说。项目运用遗传、生理生化与根际微生物生态相结合的实验手段，以功能域定位分析、宿主环境因子应答特征、突变体构建、细胞中的调控网络分析以及根际微生物多样性的影响等为主要研究内容，探究多重耐药外排泵与根际竞争性结瘤的耦合关系，为在实际生产应用中有效提高优良固氮根瘤菌的根际竞争性结瘤、增加作物氮素营养、改善土壤氮生态环境、促进作物生长提供重要科学理论依据。

豆科植物-根瘤菌共生固氮是自然界中生物在长期进化过程中形成的精妙共生关系之一，是生物固氮中效率最高的体系。共生固氮早期阶段，很多豆科植物分泌（异）黄酮类次生代谢物，这些物质可以诱导根瘤菌结瘤基因（nod）簇的表达，合成结瘤因子（Nod Factors），而结瘤因子对于结瘤过程的启动至关重要，因此（异）黄酮类物质是一类重要的有益于共生固氮的信号分子。与此同时，这些次生代谢物往往具有抑制细菌生长，甚至毒害作用。显然，（异）黄酮类物质具有“双刃剑（共生有效性与毒害作用）”的作用。根瘤菌如何响应这些物质仍然不清楚。项目以大豆慢生型根瘤菌模式菌株Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110中新发现一个对豆科植物异黄酮快速响应的TetR-like蛋白质家族成员BdtR（基因blr7023编码）为切入点，利用生理生化以及遗传学手段，系统地对该蛋白调控根瘤菌外排大豆异黄酮的作用机制进行了研究。 研究结果表明：多重性耐药外排泵操纵子（基因簇bll7019~blr7023）快速而特异地被金雀异黄酮（genistein）诱导，但是被大豆苷元（daidzein）抑制；BdtR作为阻遏蛋白，通过与bll7022上游启动子区内一处富含AT的DNA区（operator）相结合，负调控相邻多重耐药外排泵结构基因（bll7019~bll7021）的表达，并且阻遏效应的解除与异黄酮的分子结构有关；BdtR的失活导致了根瘤菌体外金雀异黄酮的过量蓄积，并且增强了细菌对其高剂量的耐受性，但是显著减弱了根瘤菌的竞争性结瘤能力；进一步研究表明，BdtR的缺失突变显著降低了genistein对结瘤基因nodY的诱导效应，但是这种效应改变与控制结瘤基因表达的关键调节因子NodD1和NodW无关。项目阐明了BdtR的调控机制，首次揭示了该蛋白质在根瘤菌权衡大豆异黄酮类物质的共生有效性（诱导结瘤基因表达）以及安全性（对根瘤菌的毒害作用），维持细菌体内异黄酮的稳态方面具有重要作用。加深了共生早期阶段，根瘤菌对这些物质的识别和响应机制认识。