电纺纤维负载固定化凝血酶用于止血材料的研究

电纺纤维在许多生物医用领域展示出良好的应用前景，然而将其与快速止血药凝血酶结合制备快速止血材料的研究尚未见报道。本项目针对目前临床常用止血材料的止血速度难以满足急救要求的现状，拟在电纺纤维表面负载凝血酶制备易于使用和储存的快速止血材料。电纺纤维膜作为凝血酶的载体可以像常用止血材料明胶海绵一样，利用多孔性物理结构达到止血的目的，而其纳米结构可以有效提高载药量。将凝血酶以共价键结合的形式负载到电纺纤维的表面可以提高其储存稳定性。本课题组在前期工作中发现，PBS制成的电纺纤维膜表面负载凝血酶以后止血速度和常用止血材料相比大大提高。本项目拟对该思路进行详细的研究，选择已经用于制备止血材料的高分子以及其它常用的生物医用高分子，进行单独纺丝、多元共混纺丝及同轴共纺等制备多种组成和结构的电纺纤维膜，研究材质和结构对负载凝血酶的能力及止血效果的影响，为未来筛选和开发适合临床使用的快速止血材料奠定基础。

本项目以获得快速止血材料为目的，把聚合物电纺纤维的多孔纳米结构和快速止血药物凝血酶相结合，制备和表征了多种具有不同组成和结构的电纺纤维负载凝血酶以及具有三明治结构的多功能多层膜材料。对临床常用止血材料明胶海绵、泰陵和强生止血纤维等进行了剖析，表明其共同特点是具有多孔结构、良好的亲水性和高的吸水倍率，但吸水后强度并不高，该结果对电纺纤维止血材料的组成和结构设计具有重要的指导意义。通过对多种具有良好生物相容性和生物可降解性的聚合物电纺纤维膜的物理机械性能、亲水性、载酶效果以及载酶样品的止血性能的研究，筛选出具有良好亲水性的载酶聚丁二酸丁二醇酯（PBS）/鸡蛋壳膜蛋白（SEP）以及载酶壳聚糖涂覆PBS电纺纤维膜为具有临床应用价值的快速止血材料，它们在大鼠肝脏模型中的止血时间短于临床常用止血材料明胶海绵。对PBS/SEP电纺纤维膜材料的细胞毒性以及在动物体内的生物安全性（组织相容性、炎症因子）进行了评估，表明该材料无细胞毒性，细胞相容性良好，肝脏组织相容性尚可。对载酶壳聚糖涂覆PBS电纺纤维膜在三种不同温度的酶活稳定性进行了研究，其低温（-34度和零度）储存稳定性和凝血酶水溶液类似，但室温储存稳定性明显高于凝血酶水溶液，载酶纤维膜在室温储存16天后仍有33%的活性存留，而凝血酶水溶液储存4天后已大部分失活。对提高电纺纤维膜亲水性的方法及引入抗菌功能的方法进行了探究，结果表明采用亲水性聚合物聚乙烯醇和壳聚糖共纺以及和氨基丙基三乙氧基硅烷偶联剂共纺是提高电纺纤维膜亲水性的有效方法，而和蛋白质（如：SEP，胶原蛋白或明胶）共纺后吸附银纳米粒子是在生物相容性电纺纤维膜中引入抗菌性的普适性方法。抗菌电纺纤维膜可以作为具有三明治结构的多层膜的夹心层使材料同时具备止血和抗菌功能。本项目的研究表明，把聚合物纳米纤维和凝血酶相结合，既利用多孔的物理结构吸附和网络血液有形成分促进血栓形成，膨胀压迫创面形成机械止血，又利用高的载药量催化止血过程，是制备快速止血材料的合理思路。该项目的研究结果为开发具有临床应用价值的新型止血材料奠定了基础。