超顺磁标记无载体FCEC移植膜片及示踪的研究

角膜内皮移植术是治疗角膜内皮病变的一种较新的方法，但存在供体短缺和术后移植片易脱落等难题，这也是当今研究的热点。本课题首先构建用于细胞培养的温敏凝胶培养皿，并检测、优化其物理特性和生物相容性；应用克隆微球分离技术获取兔眼角膜内皮前体细胞（CECP），并定向扩增收集"功能"角膜内皮细胞（FCEC）；利用温敏凝胶的亲水膨胀特性，体外构建"无载体"FCEC膜片；把超顺磁微球（SPM）标记到体外构建的膜片状FCEC内，并做为角膜内皮移植术中磁性角膜接触镜吸附固定的细胞内靶点。术后在活体、细胞和分子水平分析该方法对角膜屈光状态、植片转归、细胞周期进程及细胞"泵"功能等的影响。通过MRI分子影像学技术对体外培养的及活体兔眼FCEC示踪。探讨该方法用于治疗角膜内皮病变的有效性和可行性。本课题可望为开拓角膜内皮病变治疗的新方法奠定基础。

角膜内皮移植术是治疗角膜内皮病变的一种较新的方法，但存在供体短缺和术后移植片易脱落的难题。有报道即使技术成熟的角膜内皮移植手术医师，在采用DMEK(后弹力膜角膜内皮移植术) 时，术后一周内仍有30%的脱离率，需要再次进行前房内气泡注入使植片固定，这也是国内开展角膜内皮移植术受限的原因之一。本课题的研究内容是体外培养角膜内皮细胞移植的前驱工作，首先，通过克隆微球检测技术分离兔眼角膜内皮前体细胞（CECP），并定向扩增获取角膜内皮细胞（CEC）；采用ROCK抑制剂Y-27632可有效促进从CECP中分离出来的克隆微球形成率。通过CEC的形态学、特征蛋白标识物、离子泵功能等检测证实所培养的CEC具备特征性标识和功能，即功能性CEC（FCEC）。进而把改良制备的特定浓度的超顺磁微球（SPION）标记到体外构建的膜片状CEC内，观察到SPION对CEC的标识性蛋白表达和多种功能均无明显影响。把所构建的膜片状SPION-CEC体外放置到剥除角膜后弹力层的兔角膜基质床表面，通过外加磁场，该膜片可较快速的粘附到剥离后弹力层的长期甘油保存的兔眼角膜基质床表面。再把该重建的“SPION-CEC-甘油保存角膜”通过穿透性角膜移植的方式进行移植，术后观察6个月植片保持透明（透明率83.26%）。该方法可望为开拓角膜内皮病变治疗的新方法奠定基础。