LL-37-IL-36 axis 在肠成纤维细胞调控肠黏膜屏障中的作用机制研究

Intestinal mucosa barrier (IMB) is an important barrier to the body's defense. Intestinal epithelium of fibroblasts (ISEFs) -intestinal epithelial cells (IEC) crosstalk has been shown to be closely involved in the regulation of intestinal epithelial barrier function. Our previous studies have shown that the ISEFs play a protective role in IMB function, and found that endogenous antimicrobial peptides LL-37 plays an important role in regulation of IMB, the mechanism of this regulation has not been well understood. Several lines of evidence suggested that LL-37 can promote tissue damage repair by IL-36 upregulation, according to that we assum that LL-37 can promote IEC-derived IL-36 expression,the later binding to ISEFs surface IL-36 receptor (IL-36R), activating ISEFs secrete protective cytokine such as KGF, TGF-β to protect the intestinal epithelial barrier.In this study, we put forward the LL-37-IL-36 axis is considered to be the key pathway to regulate the intestinal barrier function by ISEFs-IEC co-culture system and necessary animal model. This proposal would give insight into the mechanism of ISEFs-IEC crosstalk in maintaining intestinal barrier homeostasis and may provide novel strategy to prevent the loss of intestinal barrier function. To further clarify ISEFs-IEC crosstalk mechanism under the condition of the pathology of IMB regulation provides theoretical basis for screening of intestinal mucosa damage protection of new targets for intervention.

肠黏膜屏障（IMB）是机体防御的重要屏障。肠上皮下成纤维细胞(ISEFs)与肠上皮细胞（IEC）之间可通过crosstalk调节IMB功能。在前一课题里我们验证了ISEFs对IMB功能的保护作用,并发现内源性抗菌肽LL-37在ISEFs对IMB的调控作用中扮演着重要角色，但机制尚不完全明确。近来研究发现, LL-37可通过上调IL-36促进组织的损伤修复，据此我们推测LL-37可通过诱导肠上皮源性IL-36的表达作用于ISEFs表面IL-36受体(IL-36R),激活ISEFs分泌KGF、TGF-β等细胞因子对肠屏障的保护促进。因此，本项目拟通过ISEFs–IEC共培养模型及小鼠IMB损伤模型，提出LL-37-IL-36 axis通路是ISEFs调节IMB的关键通路，为深入阐明ISEFs-IEC crosstalk机制在病理条件下对IEB的调控提供理论依据，筛选肠黏膜损伤保护的干预新靶点。

严重创伤、烧伤及大型手术所诱发的急性小肠缺血再灌注(IR)损伤是影响临床救治的重要问题之一。急性小肠IR损伤已成为临床诱发肠黏膜屏障（IEB）损伤的重要原因之一。我们前期研究已表明，肠上皮下的成纤维细胞（Intestinal sub-epithelial fibroblasts, ISEFs）对IEB的功能有保护作用，但其机制还需要进一步阐明。.本研究设想，IR病理条件下，肠上皮细胞（IEC）来源的抗菌肽LL-37通过调节IL-36的表达，旁分泌作用于ISEFs上的IL-36受体（IL-36R），并通过MyD88通路激活ISEFs分泌KGF等细胞因子促进肠上皮屏障的恢复，由此形成一个ISEFs-IEC调控回路。 .首先我们通过体外细胞模型将ISEFs与IEC进行共培养，分别加入LL-37及IL-36R干扰质粒，结果发现：在LPS炎症刺激下，当干扰掉ISEFs中IL-36R表达，外源性加入LL-37不能明显增加ISEFs中KGF等细胞因子的表达，肠上皮屏障功能也没有显著增强。接下来，我们利用小鼠IR模型，腹腔注射LL-37，结果发现LL-37并没有显著缓解肠屏障损伤。我们分析可能由于急性模型时间短，LL-37的作用无法在短时间内体现出来，于是我们更换为结肠炎模型。结果发现，在DSS诱导的小鼠结肠炎中，注射LL-37后，肠道纤维化相关程度有明显改善，炎症程度也明显减轻。为了进一步研究LL-37的作用机制，我们检测了一系列细胞因子及转录因子的表达，发现IL-36家族和缺氧诱导因子（HIF-1α）均明显升高。接下来，我们分别构建了IEC特异敲除HIF-1α的小鼠（Hif1-αΔIEC）和IL-36R全敲小鼠（IL-36R-/-）进行造模。实验结果发现，Hif1-αΔIEC小鼠肠道中肠上皮间淋巴细胞（IELs）数量明显高于WT小鼠，并且IELs种群比例发生了明显变化，在DSS诱导的结肠炎中，Hif1-αΔIEC小鼠结肠长度却明显短于WT小鼠，结肠组织结构损坏明显加重；并且在给予LL-37后，Hif1-αΔIEC小鼠的症状并未得到缓解。同时，我们也利用IL-36R-/-小鼠进行沙门菌肠炎造模，发现IL-36R-/-小鼠炎症程度明显加重，给予LL-37也未能逆转。这提示我们，LL-37对肠道的保护功能在不同肠炎中发挥的作用机制可能不一样。通过本项目，我们将深入了解LL-37在