结肠癌相关成纤维细胞源性骨桥蛋白与结肠癌新生血管关系的实验研究

Angiogenesis is essential for tumor growth, invasion and metastasis. In the past, endothelium-dependent vessel (EDV) is considered as the unique form of the tumor microcirculation. The finding of vasculogenic mimicry (VM) enrichs the theory of angiogenesis, suggesting that in the design of antiangiogenic treatment programs must also consider the role of VM. Recent study reveals that cancer associated fibroblasts (CAFs) and Osteopontin (OPN) plays an important regulatory role in EDV and VM formation. In this study is based on the correlation of CAFs、OPN、EDV、VM and its role in colon cancer clinicopathological relationship, Using OPN-specific siRNA lentiviral expression vector (LV-OPNshRNA) to establish stably transfected with LV-OPNshRNA human colon cancer cell lines (LOVO), and colon CAFs respectively, in vitro cell culture and in vivo nude mice experiments, analysis of the impact of the formation of colon CAFs derived OPN to EDV and VM, revealing the biological functions of CAFs endogenous OPN and PI3K/Akt pathways in angiogenesis, to provide a theoretical basis to explore the tumor-targeting gene therapy.

肿瘤内血管形成是恶性肿瘤生长、侵袭与转移的重要前提，通常认为内皮依赖性血管（EDV）是肿瘤微循环的唯一形式。血管生成拟态（VM）的发现丰富了血管形成理论，提示在设计抗肿瘤血管治疗方案时，必须同时考虑对VM的作用。目前研究发现，癌相关成纤维细胞（CAFs）及OPN在EDV和VM形成过程中都具有重要的调节作用。本项目在研究结肠CAFs、OPN、EDV、VM间的相关性及其与结肠癌临床病理关系的基础上，通过构建OPN特异性siRNA慢病毒表达载体（LV-OPNshRNA），建立稳定转染LV-OPNshRNA的人结肠癌细胞株（LOVO）和结肠CAFs，分别进行体外细胞培养和裸鼠体内成瘤实验，分析结肠CAFs源性OPN对EDV和VM形成的影响，揭示CAFs源性OPN及PI3K/Akt通路在血管生成中的生物学功能，为探索肿瘤靶向基因治疗提供理论依据。

恶性肿瘤间质中的癌相关成纤维细胞（CAF）可以显著调控肿瘤细胞的表型。为了探索CAF对结肠癌细胞的侵袭、转移和血管生成的影响，我们首先进行了CAF的原代分离和培养，与结肠正常成纤维细胞（NF）相比，CAF分泌的OPN、TGF-β、VEGF、MMP-2明显增多。将CAF与结肠癌LOVO细胞体外共培养，发现CAF具有增强LoVo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的能力；而裸鼠的体内成瘤研究，也证实了CAF能够促进结肠癌细胞的侵袭、转移和新生血管生成。.其次我们在三维（Matrigel胶）培养条件下，设立CAF上清液组、LoVo 细胞上清液组、CAF共培养组、LoVo 细胞共培养组，分别与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养，结果发现CAF上清液处理组和CAF共培养组，形成的血管状结构较多，比较密集，其形成的血管状结构的面积较大，表明二者促进HUVEC 成管的能力较强，与其他组相比差异具有统计学意义。另外通过ELISA和Western blot实验结果证实CAF上清液组及CAF共培养组中MMP-2、MMP-9、VEGF、OPN含量明显高于LoVo上清液组及LoVo共培养组。说明存在肿瘤间质中的CAF相比肿瘤细胞，通过分泌促血管生成活性因子，更能加速肿瘤的血管新生。. 骨桥蛋白（OPN）在高转移能力的肿瘤细胞中频繁的高表达，因此被认为可作为肿瘤治疗的潜在靶点。为了探索沉默结肠癌LOVO细胞中的OPN基因的作用，我们构建靶向人骨桥蛋白（OPN）基因短发夹RNA（OPN-shRNA）的质粒表达载体，并且转入LOVO细胞，发现沉默OPN基因可以抑制结肠癌LOVO细胞的增殖、黏附及侵袭能力，并减少VEGF、MMP-2、MMP-9及uPA等血管生成相关因子的分泌。.为了探讨肿瘤间质CAF源性骨桥蛋白在结直肠癌中的表达与临床病理及脉管生成的关系，我们运用免疫组化二步法检测75例结直肠癌组织CAF源性骨桥蛋白及微血管（MVD）和淋巴管（LVD）的表达情况，分析CAF源性骨桥蛋白表达与临床病理及脉管生成的关系。结果发现CAF源性骨桥蛋白在结直肠癌中的高表达与性别、年龄、肿瘤大小无关，与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有一定关系。CAF源性骨桥蛋白的高表达与MVD 、LVD呈正相关关系，提示CAF源性OPN与MVD 、LVD生成关系密切, 与肿瘤血管、淋巴管的生成和肿瘤的浸润及转移有一定关系。CA