棉花CMS育性恢复相关基因的高通量分离及功能鉴定

Use of cytoplasmic-male sterility (CMS) is an effective way to break through the bottleneck of hybrid seed production and heterosis utiliazation. The practicable importance of CMS breeding is dependent on a stable restorer line. Isolation and characterization of related prominent genes is an important foundation for the molecular breeding of fertility restorer line.Previoursly in our exploratory study using cellular and molecular methords, we found the sterility recovery rate and degree of 777R were 100%.However, because of the complexcity of genome and fewer of the referrence genome sequences in cotton, it's difficult to separate fertility restorer related genes using traditional methords. In this application issue, focusing on characterization of fertility related genes, three high troughput technologies (trancriptome sequencing, digital gene expression profiling and dimensional gel electrophoresis) combined with bioinfomatic analysis, will be used to analyze the genome-wide gene expression variation among CMS 777A, maintainer 777 and restorer 777R. Expected to screen out 3-5 CMS fertility restoration related candidate genes, and transgenic methords will be used to identify their roles.

利用CMS实现三系配套是解决目前我国棉花杂交制种成本过高，促进杂种优势利用的有效途径之一，而优良恢复系的选育是其关键突破口。开展棉花CMS育性恢复的机理研究，鉴定出相关的基因是进行恢复系分子育种的重要基础,申请者在细胞学和分子水平进行了探索性研究，发现777R恢复度和恢复率均达到100%，但棉花基因组比较复杂且可参考序列信息较少，采用传统方法很难对育性恢复基因进行分离和鉴定。因此，本申请课题将以棉花育性相关基因分离和鉴定为研究核心，利用转录组测序、数字基因表达谱分析、蛋白质双向电泳等高通量技术，结合生物信息学分析，在全基因组水平上分析恢复系777R与其同型不育系和保持系之间差异表达的基因，筛选出3-5个与CMS育性恢复相关的重要候选基因，采用转基因方法鉴定其功能。

优良恢复系的选育，是利用CMS实现棉花三系配套的关键，目前其恢复机理尚不清楚。本研究利用石蜡切片、基因表达谱测序、蛋白双向电泳等技术手段，对新转育棉花CMS 777A，及其恢复系777R、保持系777进行研究发现：1）777A败育发生在造孢细胞增殖到减数分裂期，主要处于棉花现蕾3-5d的时期。2）差异表达的基因中，777R较777有135个上调表达，342个下调表达，主要参与化学刺激响应、氧化还原反应、离子转运等生物进程；777R较777A有602个上调表达，145个下调表达上调表达，主要参与细胞组分形态发生、花粉发育、配子体发育、花粉壁形成等生物进程。3）蛋白双向电泳结果发现，777R与不育系777A和保持系777比较，3倍以上差异的蛋白点数分别为23和15，有无差异点数分别为31和33。分别对777R对应777A和777的 14个和10个特异蛋白点进行质谱分析，鉴定结果显示，这些基因主要参与氧化还原、蛋白代谢/修复、糖酵解等生物进程。其中Enolase、Ribulose bisphosphate carboxylase large chain、Ascorbate peroxidase 和Triosephosphate isomerase这4个基因在777R与777、777A的比较中均特异表达，推测其可能参与育性恢复的调控，下一步将重点进行其功能及调控途径的解析。