激活β-肾上腺素受体对人正常和移植颌下腺粘蛋白分泌的影响及机制研究

Autotransplantation of the submandibular gland is one of the effective approaches for treating severe keratoconjunctivitis sicca. However, after operation, the fluid from transplanted glands could not form a stable tear film in ocular surface, which may easily lead to epithelial damage. Increasing the content of mucin in transplanted glands fluid could contribute to the formation of the tear film, so as to strengthen the protective effect of the structure of the ocular surface. Since the protein secretion in submandibular gland is mainly regulated by β-adrenoceptor (β-AR), the expression of β-AR in normal and transplanted glands as well as the effects of β-AR on mucin secretion need to be further studied. In this study, we will use physiological and pharmacological methods to clarify the expression of β-AR in human normal and transplanted submandibular glands, to reveal that the activated β-AR could promote mucin secretion by activating cAMP and PKA, and then forming SNAREs complex in an F-actin dependent manner, and to propose that β-AR might become the target to regulate mucin secretion of transplanted glands. This study will provide better understanding in the molecular mechanism of protein secretion in submandibular glands, and offer a basis for exploring new therapeutic strategies to increse the mucin secretion and strengthen the protective effect of the structure of the ocular surface.

血管化自体颌下腺移植以颌下腺分泌液代替泪液是治疗重症干眼症的有效方法，但术后泪膜稳定性不足。若能提高移植腺体分泌液中粘蛋白的含量，将有助于术后泪膜的稳定及眼表健康的维持。β-肾上腺素受体(β-AR)是调控涎腺蛋白质分泌的主要分子，其对正常和移植颌下腺粘蛋白分泌的影响及作用机制还需进一步研究。本课题拟采用生理学和药理学方法，明确正常和移植颌下腺中β-AR的表达；揭示激活β-AR通过cAMP和PKA，以F-actin依赖的方式促进分泌颗粒向胞膜运动，形成SNAREs复合物，介导分泌颗粒与胞膜的融合及粘蛋白的分泌；提出β-AR可作为人工调控移植颌下腺粘蛋白分泌的靶点。该研究将丰富和完善颌下腺蛋白质分泌的理论，为人工调控移植颌下腺粘蛋白的分泌提供实验依据，增强移植腺体分泌液对眼表结构的保护作用。

背景：.血管化自体颌下腺移植术是治疗重症角结膜干燥症的有效方法。移植术后，部分患者出现“泪溢”现象，移植腺体分泌增多；此外，移植腺体分泌液中唾液淀粉酶的活性增加，总蛋白质含量增加，移植腺体的蛋白质分泌机制改变。.结果：.使用PCR和Western blot方法，检测人颌下腺中有β-AR1和β-AR2的表达，且在移植颌下腺中，β-AR1和β-AR2的表达增加；PKA作为激活β-ARs的重要下游信号分子，在移植腺体中，p-PKA的表达也升高。使用免疫荧光的方法，检测在正常人下颌下腺中，F-actin主要分布于腺泡细胞的顶侧膜及基底膜附近，使用10 μM的异丙肾上腺素IPR刺激30 min, F-actin在顶侧膜附近的表达增加，在基底膜附近的表达减少；在移植腺体中，F-actin主要分布于基底膜附近，IPR刺激同样使F-actin在顶侧膜附近的表达增加，在基底膜附近的表达减少。这一结果提示：F-actin的分布受β-AR的调节；F-actin在顶侧膜的表达增加，可能参与由β-AR调节的蛋白质分泌。SNARE复合物介导分泌颗粒与细胞膜的融合。使用PCR方法，检测人下颌下腺中，有VAMP-2，syntaxin-4，SNAP23分子的表达；且在移植腺体中，VAMP-2，syntaxin-4的表达较对照组增加。使用免疫共沉淀的方法，检测人下颌下腺中，syntaxin-4和actin均能与VAMP-2结合。提取腺体组织的分泌颗粒组分，发现移植腺体中VAMP-2, syntaxin-4和actin表达均升高。为了进一步证明syntaxin-4，actin和VAMP-2相互作用是否参与蛋白分泌，及探讨其机制，我们使用IPR刺激，发现分泌颗粒中VAMP-2, syntaxin-4和actin表达均升高;使用PKA的抑制剂和（或）F-actin聚合的抑制剂，抑制了激活β-AR引起的VAMP-2, syntaxin-4和actin表达增加，单独使用抑制剂对三个分子的表达没有影响。.结论：.在人下颌下腺中，激活β-AR，通过PKA和F-actin依赖的方式，增加VAMP-2和syntaxin-4的相互作用，促进腺体蛋白质分泌；在移植下颌下腺中，上调的β-AR通过增加VAMP-2和syntaxin-4相互作用，参与移植腺体的蛋白质分泌异常。