高同型半胱氨酸抑制NR2B甲基化在POCD发生中的作用及机制研究

Postoperative cognitive dysfunction (POCD) is one of the long-term postoperative complications. The mechanism of POCD is unclear, lacking of the effective therapy. Our pilot study showed that elderly mice were more susceptible to POCD than young mice, the concentration of homocysteine (Hcy) in elderly mice was also higher; In the hippocampus of postoperative elderly mice, the expression of NR2B was enhanced and the methylation of NR2B promoter was decreased; Preoperative supplementation of vitamin B12 decreased the concentration of Hcy, reversed the postoperative reduction of NR2B methylation, and improved POCD in elderly mice. Previous studies have found that Hcy regulates cognitive function by inhibiting DNA methylation through methionine cycle and enhancing the expression of specific gene, in addition, the expression of NR2B can be regulated by methylation, NR2B overexpression results in calcium overload and subsequently leads to neuron damage. Based on this, we propose a hypothesis: elevated Hcy could inhibit the methylation of NR2B through methionine cycle, up-regulate NR2B expression and result in calcium overload, subsequently lead to neuron damage and produce POCD. The current study aims to investigate whether Hcy regulates POCD by inhibiting NR2B methylation, using in vivo microdialysis, CHIP and electrophysiology in animal POCD model established by abdominal exploration. This study is to provide a new idea for the mechanism research and a novel treatment for POCD in clinic.

术后认知功能障碍（POCD）是患者术后长期严重并发症之一，但发病机制不清、治疗手段缺乏。我们前期研究发现老年鼠POCD的易感性高于青年鼠，其血清同型半胱氨酸（Hcy）含量较高；老年鼠术后海马NR2B表达增强，NR2B甲基化水平降低；术前补充维生素B12可降低Hcy，逆转手术所致的NR2B甲基化水平降低，改善老年鼠POCD。由于Hcy可经蛋氨酸循环抑制DNA启动子甲基化、增强特定基因表达调控认知功能，且NR2B表达受甲基化调控，其过量表达可引发胞内钙超载损伤神经元，我们推测：高Hcy经蛋氨酸循环降低NR2B启动子甲基化水平、促进NR2B 蛋白表达，引发胞内钙超载，进而导致神经元损伤，造成老年鼠POCD。本课题拟通过腹腔探查术构建POCD模型，利用在体微透析、CHIP、电生理等技术，明确Hcy是否通过抑制NR2B甲基化调控POCD发生，为POCD的发病机制和临床防治提供新思路和新方法。

术后认知功能障碍（POCD），是以学习记忆损伤为主要表现的术后神经并发症，发病率19.2%-46%，一旦发生术后死亡率将增加40%，远期痴呆风险增加8.9倍，是目前国际医学研究的热点及难点。研究发现老龄是POCD的独立危险因素。那么，老年人为何对 POCD的易感性增高？ 随着年龄的增长，老年人各项器官功能逐渐衰退，最终无法再继续维持人体正常生理需求，导致营养不良及其并发症的发生。维生素是老年人最容易缺乏的营养成分之一。近年来，维生素 B 缺乏及其诱导的同型半胱氨酸（Hcy）升高受到了广泛的关注。基于此，我们提出了如下关键科学问题：血清Hcy增高是老龄人群对POCD易感的原因吗？Hcy影响POCD发生的机制是什么？为了回答以上问题，本课题利用模式动物C57BL/6小鼠，采用WaterLOGSY、X射线晶体学、病毒学、电生理等技术，对上述问题进行深入探讨，主要发现：①成功构建“全麻下剖腹探查术”POCD动物模型，明确老龄是POCD发生的重要风险因素，发现高同型半胱氨酸对老年鼠易感POCD至关重要，饮食补充维生素B12及叶酸可通过降低Hcy浓度进而改善老年小鼠POCD症状。②利用RNA-seq和RRBS甲基化组学，我们鉴定到7314个差异甲基化CPG位点以及2624个差异表达基因，其中包括DNA甲基化酶Dnmt3a；明确Dnmt3a在POCD病理中发挥着重要作用。③明确了海马NR2B蛋白表达降低是老年小鼠POCD发生的重要原因。④POCD小鼠海马NR2B启动子甲基化水平增加，且与SAM浓度下降密切相关；术前补充SAM可降低麻醉手术后老年小鼠海马区NR2B启动子甲基化水平，增加NR2B mRNA及蛋白表达，改善LTP；术前补充SAM可呈浓度依赖性地改善老年小鼠POCD症状。⑤麻醉剂异氟醚可直接抑制同型半胱氨酸代谢酶CBS活性，CBS是有转化前景的干预靶点。以上结果表明：高Hcy可经蛋氨酸循环影响NR2B启动子甲基化水平及其mRNA、蛋白表达，进而导致神经元突触可塑性损伤，造成老年鼠POCD。本课题不仅探索了高Hcy对POCD的预警能力，还探索了维生素B12、叶酸、SAM等药物对POCD的防治作用，为POCD的发病机制和临床防治提供新思路和新方法。