N-myc对长链非编码RNA-ncRAN的转录调控作用研究

长链非编码RNA在恶性肿瘤发生、发展等诸多方面均展现了核心调控作用，关于其生物学功能及调控机制的研究已成为非编码RNA领域的前沿课题。申请者最近在高度恶性神经母细胞瘤中鉴定了一个具有癌基因功能的长链非编码RNA-"ncRAN"。前期研究中我们进一步发现外源转染N-myc可引起细胞内ncRAN表达的上调，而且生物信息学分析提示ncRAN启动子区含有多个myc结合位点，提示ncRAN是一个新的N-myc靶基因。本研究拟在此基础上，综合采用启动子报告基因分析、EMSA、ChIP多种分子生物学方法，证明ncRAN是N-myc的直接转录靶点；并进一步通过体外细胞实验和动物实验深入阐释ncRAN在N-myc促癌信号转导通路中的重要作用。本课题对于新兴的长链非编码RNA的转录调控机制研究、经典癌基因N-myc的分子行为机制研究、以及神经母细胞瘤核心治疗靶点的鉴定均具有重要的理论和现实意义。

长链非编码RNA在恶性肿瘤发生 发展等诸多方面均展现了核心调控作用, 关于其转录机制和生物学功能的研究已成为非编码RNA领域的热点前沿。在本项目中, 通过采用血清饥饿/ARTA联合处理神经母细胞瘤细胞系 RTBM1，我们发现不仅内源性N-myc被诱导表达，而且内源性ncRAN的表达也随之上调；类似地，如果用siRNA 沉默内源性 N-myc 基因表达处理神经母细胞瘤细胞系 CHP134，则可发现内源性N-myc表达下降的同时，内源性ncRAN的表达水平也随之下调；我们进一步构建了单一质粒四环素调控载体pCEP4-tetR-N-myc, 将其转染至神经母细胞瘤细胞系RTBM1后, 发现四环素诱导组的N-myc、ncRAN表达均较未诱导组、空载体组与对照组明显增加。上述结果充分证明了N-myc的表达变化对内源性ncRAN的表达有直接的影响。在此基础上，我们也完成了ncRAN启动子调控报告基因重组系列载体及其系列删除体的构建工作。我们运用UCSC数据库分析了ncRAN起始位点上游（0~ -3000bp)启动子区，应用荧光素酶报告基因分析法,确定N-myc结合位点集中位于起始位点上游0~ -600bp以内。进而，通过染色质免疫沉淀实验证实 N-myc 与ncRAN 启动子第四结合位点区域 E-box 位点的结合。另一方面，我们通过体外和体内功能实验阐明了N-myc对ncRAN转录调控的生物学意义。在ncRAN高表达的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中，沉默ncRAN, 细胞表现为生长抑制;如向SY5Y中转入N-myc或同时转入干扰ncRAN表达的shRNA及对照siRNA，则转染shncRAN组部分抑制了N-myc的促增殖作用。与之相一致的是，体内实验也证实，过表达/沉默ncRAN可相应促进/抑制移植瘤的生长。上述研究结果充分验证了我们提出的假说，即ncRAN作为N-myc的直接靶基因，参与了N-myc介导的神经母细胞瘤恶性转化及发展。本研究对于新兴的长链非编码 RNA 的转录调控机制研究、经典癌基因 N-myc 的分子行为机制研究、以及神经母细胞瘤核心治疗靶点的鉴定均具有重要的理论和现实意义。