化香树果序醇提物调控RAS/MAPK/AP-1信号通路诱导鼻咽癌细胞巨泡式死亡机制研究

Our preliminary study showed that ethanol extract of infructescence of Platycarya.strobilacea Sieb.et Zucc. (EPS) is associated with the generation of cell fusion, perturbation of lysosomal vesicle transportation and the induction of methuosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell lines while this is not observed in the normal nasopharyngeal cell. Thus, we speculate that EPS may has anticancer effects. Network pharmacology analysis were conducted indicating that EPS mainly regulates the RAS/MAPK/AP-1 signaling pathway. So we hypothesis that the effects of EPS in NPC cells may be achieved through its regulation of the RAS/MAPK/AP-1 signaling pathway. Therefore this project is to further study the human NPC cell lines CNE1 and CNE2 which were treated with EPS. Firstly using RNA sequencing (RNA-seq), isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ), Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), bioinformatics and other technical methods, we will identify the potential targets in the RAS/MAPK/AP-1 signaling pathway. Secondly, the related gene function analysis will be investigated by plasmid transfection, shRNA interference and small molecule inhibitors technology. Finally, exam the treatment of EPS on NPC model in vivo. The results will provide important scientific basis for the anticancer effects of EPC in NPC cells and expand the understanding of methuosis.

我们前期研究表明，化香树果序醇提物(EPS)可诱导鼻咽癌细胞相互融合，胞内产生大量囊泡形成巨泡式死亡，而EPS在正常鼻咽细胞中无此作用，据此推测EPS有望用于鼻咽癌抗肿瘤治疗。网络药理学分析及验证发现EPS可作用于RAS/MAPK/AP-1信号通路进而调控下游基因，由此我们提出假说：EPS诱导鼻咽癌细胞巨泡式死亡的机制可能是通过调控RAS/MAPK/AP-1信号通路及其下游靶基因来实现。我们拟进一步以EPS处理的鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2为研究对象，首先采用转录组、蛋白质组、染色质组、生物信息学等技术分析RAS/MAPK/AP-1信号通路下游靶基因、靶蛋白及其结合位点，其次用质粒转染、shRNA干扰和小分子抑制剂等方法进行基因功能分析，最后在鼻咽癌动物模型中验证EPS诱导巨泡式死亡以及抑制肿瘤细胞生长的作用机制。研究结果将为寻找治疗鼻咽癌新的药物提供重要线索，并拓展对巨泡式死亡的认识。

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是源于人鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤，我国近5年内诊断为鼻咽癌患者约13.85万。目前鼻咽癌的临床治疗主要是放疗为主、化疗、免疫治疗等综合治疗模式，尚无特效药物。前期研究发现，治疗鼻炎的常用中药化香树果的醇提物（ethanol extract of infructescence of Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc.，EPS）可以抑制鼻咽癌CNE1、CNE2细胞的增殖。我们研究采用EPS 1.0 mg/mL作用于CNE1、CNE2细胞，结果显示4 h后细胞形成丝状伪足、板状伪足，12 h后细胞膜进一步相互融合，24 h后细胞内出现大量不断融合增大的囊泡，并最终导致细胞膜破裂死亡，与凋亡等其他死亡方式具有显著区别，与巨泡式死亡阳性对照药物MOMIPP作用于鼻咽癌细胞的表型一致。而相同浓度EPS作用于正常鼻咽NP69细胞中无此作用，表明EPS诱导鼻咽癌细胞发生巨泡式死亡。为探索起机制，我们首先采用质谱、气相、液相鉴定了EPS成分，提示其中含有没食子酸、鞣花酸、熊果酸、谷甾醇等酸性多酚类化合物和黄酮类化合物，并且鞣花酸是导致细胞内出现囊泡的主要成分。荧光探针染色显示细胞蛋白骨架、溶酶体均在细胞形态改变过程中发挥了重要作用。进一步使用转录组、蛋白质组、代谢组、网络药理学分析及WB验证发现EPS可作用于RAS/MAPK/AP-1信号通路进而调控下游基因，EGFP-FOS过表达质粒可挽救了EPS导致的细胞巨泡式死亡，并在鼻咽癌动物模型中验证了EPS通过FOS抑制肿瘤细胞。最后，我们从临床转化的角度探索了制备EPS固体分散体的工艺流程，EPS-MF型态固体分散体药物释放率最高，溶出速度也最快，制备的EPS固体分散体增强了EPS的溶出，提高了EPS的化学稳定性。综上，研究结果将为寻找治疗鼻咽癌新的药物提供重要线索，并拓展对巨泡式死亡的认识。