肿瘤相关巨噬细胞来源CD14+B7-H3+外泌体在肾癌远处转移中的作用和机制

As an “information carrier”, exosome fulfills the biocommunication between cells and plays a significant role in tumor metastasis. However, the function and mechanism of its immunological property in tumor metastasis remains unclear. With the use of exosome detecting technique established, we found a novel group of CD14+B7-H3+ exosome derivered from mononcyte/macrophage, and noticed its “specificity” expression in the peripheral blood of renal cancer patients. In consideration of the functions of B7-H3, Tumor associated macrophages and exosome in tumor metastasis, we speculate CD14+B7-H3+ exosome can affect the immune microenviroment of remote organs by forming a “pre-transferring niche”, and thus promote renal cancer metastasis. To verify the hypothesis above, based on the analysis of CD14+B7-H3+ exosome’s diagnostic value on renal cancer, this project is intended to study on the exosome’s inhibiting ability and molecular mechanism by experiments in vitro and vivo, and to estimate the influence of intervening CD14+B7-H3+ exosome on renal cancer’s remote transfer. In a word, with the basis of original discovery, this topic is aimed at enriching the theories of exosome inducing renal cancer’s metastasis as well as evaluating its clinical usability as tumor marker. Therefore, it is embodied with favorable innovativeness and application future.

外泌体作为“信息载体”实现细胞间生物通讯，在肿瘤转移中发挥重要作用，然而其免疫学属性在肿瘤转移中的作用和机制尚不清楚。利用前期构建的外泌体检测技术，课题组发现了一群单核巨噬细胞来源CD14+B7-H3+新型外泌体，并发现其在肾癌患者外周血中呈现“特异性”表达。鉴于B7-H3、单核巨噬细胞以及外泌体在肿瘤转移中的作用，我们推测CD14+B7-H3+外泌体可通过形成“预转移龛”，影响远处器官免疫微环境，进而促进肾癌转移。为验证上述假说，在分析CD14+B7-H3+外泌体在肾癌诊断价值的基础上，本项目拟通过体内外实验研究该群外泌体对T细胞的抑制能力和分子机制，并探讨干预CD14+B7-H3+外泌体对肾癌远处转移的影响。总之，本课题在原创性发现的基础上，旨在丰富外泌体介导肾癌远处转移的理论学说，同时评估其作为肿瘤标志物的临床实用性，具有较好的创新性和运用前景。

目前肾透明细胞癌主要以手术治疗为主，靶向药物治疗为辅，但远处转移患者治疗方法有限，且预后欠佳。骨髓间充质干细胞外泌体在抑制肿瘤生长方面具有积极作用，用以纠正肿瘤基因表达障碍，但在肾透明细胞癌治疗方面研究较少。本研究主要从生物信息学以及细胞水平分析miR-502-3p与NCAPG2的作用关系，探究miR-502-3p与NCAPG2对肾透明细胞癌细胞生物学功能的影响，以及人骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-502-3p在体内外对肾透明细胞癌的抑制作用，为骨髓间充质干细胞外泌体装载miRNA用于治疗肾透明细胞癌研究提供参考。TCGA数据库中，miR-502-3p在肾透明细胞癌组织中表达低于正常组织；联合TCGA和GTEx数据及GSE40435和GSE53757集显示肾透明细胞癌组织中NCAPG2表达高于正常肾组织；四个预测数据库及双荧光素酶报告实验显示miR-502-3p与NCAPG2有靶向关系；在临床20对配对肾透明细胞癌样本及肾癌细胞系中存在同样趋势；在生物学功能实验中，miR-502-3p mimic组的786-0和ACHN细胞增殖、迁移、侵袭能力降低，且凋亡能力升高，而miR-502-3p inhibitor组趋势相反；siNCAPG2组的786-0和ACHN细胞增殖、迁移、侵袭能力降低，且凋亡能力升高；TEM观察外泌体为类圆形，NTA分析其直径在100 nm左右，且蛋白CD63和CD9呈阳性；绿色荧光蛋白PKH67标记的BMSC来源的的外泌体在ACHN细胞核周围，主要在胞质中；miR-502-3p mimic处理BMSC，其分泌的外泌体中miR-502-3p表达高于mimic-NC组，且ACHN摄取外泌体后，ACHN细胞中的miR-502-3p表达上调；共培养BMSC和ACHN，利用GW4869处理BMSC会导致ACHN摄取的miR-502-3p也减少，导致其迁移和侵袭能力也减弱；分别共培养BMSC LV-NC或BMSC LV-miR-502-3p mimic与786-0或ACHN，LV-miR-502-3p mimic组786-0和ACHN细胞增殖、迁移、侵袭能力降低，而凋亡细胞增多；动物实验显示BMSC LV-miR-502-3p mimic组在体肿瘤体积和重量小于NC组和LV-NC组，且miR-502-3p的表达水平高于其他两组，而NCAPG2趋势相反。