钛种植体表面还原响应型双基因有序控释聚电解质超薄膜的构建

A variety of growth factors play different biological effects in the process of osseointegration between titanium implant and bone tissue at different stages. Layer by layer assembly technology can be used to prepare gene delivery multilayers by using transduced DNA encoding growth factors and oppositely charged polyelectrolyte on the surface of titanium implants. Changing the distribution of different genes between multilayers allow the implant release different genes at different stages in site. Then the cells of surrounding tissue might be transfected and express growth factors in high concentration in the local which can compensate for the deficiencies of the application of exogenous growth factors. The reduction-sensitive cationic polymer can be used to assemble DNA which will protect the DNA from degradation by the body fluid or blood in vivo as well as effectively promote their escape inside cell. Given the different needs of growth factors in the process of osseointegration at different stages, this study intends to prepare the reduction-sensitive and sequential dual gene delivery polyelectrolyte multilayers on the surface of titanium implants. Plasmid DNA encoding BMP-2 and IGF-1 will be assembled between different polyelectrolyte layers, so that one kind of pDNA can be released in early stage of osseointegration and the other can be released in the late stage, thus different DNA can be transfected by cells which play their biological role in different stages. In situ sequential gene delivery manner in consistent with the physiological process of implant osseointegration is expected for providing new research idears for future clinical applications to improve the efficiency of the titanium implant osseointegration and shorten the time of bone healing.

多种生长因子在钛种植体-骨界面骨整合过程中的不同阶段发挥不同的生物学效应。利用层层自组装技术可在钛种植体表面交替吸附编码生长因子的可转导DNA以及带相反电荷的聚电解质形成多层基因控释超薄膜，通过改变各组装层间不同基因的分布可使其在植入原位分阶段释放基因，转染周围组织细胞，使生长因子在局部高表达，可弥补应用外源性生长因子的不足。利用还原响应型阳离子聚合物组装DNA可在体内有效保护DNA并促进其在细胞内的逃逸。鉴于骨整合不同阶段对生长因子的需求不同，本课题拟在钛种植体表面构建还原响应型双基因有序控释超薄膜，分别将编码BMP-2和IGF-1的质粒DNA 组装在不同的聚电解质层之间，使其能在骨整合的前期和后期分别释放两种DNA，从而发挥各自的生物学作用。这一原位基因的有序控释方式符合种植体骨整合的生理过程，有望为将来临床应用中提高钛种植体骨整合的效率和缩短骨愈合的时间提供新的研究思路。

阳离子聚合物作为一类非病毒基因载体，可以携带大量DNA，结构设计灵活，使用安全，在基因治疗领域具有无可比拟的优势。阳离子聚合物既可以直接包裹DNA形成纳米颗粒，携带DNA进入靶细胞完成基因传递，也可以通过层层自组装的方式，将DNA吸附到固相载体上，通过自身的降解释放DNA转染靶细胞。本研究使用了两种不同结构的阳离子聚合物/胶束分别在体外对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）进行了上述两种方式的基因转染，通过检测DNA的控释能力，基因转染效率，细胞相容性，以及对干细胞表面标志物和干细胞分化能力的影响，评价这两种方式在基因治疗领域应用的可行性。在之前的研究基础上，以经典的阳离子脂质体Lipofectamine2000和阳离子聚合物聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）转染作为对比，采用侧链带伯氨基的阳离子聚合物Polymer1b包裹绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1体外转染BMSCs。转染后的BMSCs的干细胞表面标志物CD44(+)，CD29(+)，CD90(+)，CD54(+)，CD105(+)，CD34(-)，CD45(-)，HLA-DR(-)与未转染的细胞相比，各组转染的BMSCs除CD54(+)稍有升高之外，其余均无明显差异。在干细胞分化方面，与PEI近似，Polymer1b的转染有一定的促进细胞向成骨方向分化的能力，且对晚期成骨促进作用更为明显；促进BMSCs向成脂方向分化；对于BMSCs早期向初级神经元分化具有一定促进作用，对于BMSCs晚期向成熟神经元分化却具有一定的抑制作用。而阳离子脂质体Lipofectamine2000虽然在影响BMSCs成脂肪和成神经方向分化方面的作用与阳离子聚合物的结果相似，在影响BMSCs成骨方面却出现了相反的结果，抑制了BMSCs向成骨方向分化。阳离子聚合物Polymer1b转染BMSCs对其干细胞表面标志的影响较小，对干细胞的分化方面的影响有利于其成骨和成脂方面的分化，结果提示这种阳离子聚合物在基于BMSCs的骨组织再生和脂肪再生基因治疗领域中的应用有一定的潜质。另一部分实验采用两亲性聚合物胶束PM3在SLA钛表面通过层层自组装方式组装pEGFP-C1，与阳离子PEI组装DNA，以及阴离子透明质酸钠组装Polymer1b/DNA聚合物作为不同