克隆与鉴定调控人类表皮角质细胞分化的重要转录因子

The epidermis is a stratified epithelium that functions as a barrier protecting the organism from dehydration, mechanical trauma, and microbial insults. A large body of evidence has shown that epidermal barrier dysfunction is associated with various skin disorders, including atopic dermatitis, psoriasis, ichthyosis vulgaris, and skin cancers. Epidermal barrier function is established through a complex and tightly controlled terminal differentiation program that is associated with many genes' turn-on and turn-off. Although there were extensive studies on the protein and lipid composition of epidermal barrier, the transcriptional regulation of this process in human epidermis is largely unknown. In this study, we propose to use two hypothesis-free methods, human transcription factor siRNA library screening and comparative analysis of gene expression profiles of human primary epidermal keratinocytes at various differentiation stages, to identify the key transcription factors that are involved in epidermal keratinocytes terminal differentiation and epidermal barrier formation. The candidate genes identified from the two methods will further characterize their regulating targets, signaling pathways they are involved in, and their association with human skin disorders. The findings from this study will significantly enrich our understanding to the mechanisms of the transcriptional regulation of epidermal keratinocytes terminal differentiation, and provide new insights to the pathogenesis of skin barrier disorders. And most importantly, it may shed light to more effective strategies for the treatment of the related human skin diseases.

皮肤表皮屏障是防止机体脱水和各种外部环境因子损伤的最重要的一道屏障。大量的研究证据表明表皮屏障功能的异常与多种皮肤疾病有关。表皮屏障功能的形成是表皮基底层分裂产生的子细胞进行终末分化的结果。表皮角质细胞终末分化过程是一个在时间和空间上严密调控的过程，涉及到一系列的基因的活化和失活。目前，对这一重要生理过程的转录调控机制的理解十分缺乏，特别是，对人类表皮角质细胞终末分化过程的转录调控的研究几乎是空白。本项目拟应用体外钙离子诱导的人类原代表皮角质细胞分化系统，采用两条不同的技术路线，人类转录因子siRNA文库筛选和基因芯片技术比较不同分化阶段人类原代表皮角质细胞的基因表达谱，克隆与鉴定参与人类表皮角质细胞分化的重要转录因子。本项目的研究结果将会极大地增进我们对人类表皮屏障转录调控机制的理解，加快对多种皮肤疾病发病机理的正确诠释，并为相关皮肤疾病的防治提供新的研究方向。

皮肤是人体最大的器官，是防止人体脱水，保护各种外部环境因子的损伤，维持体温的一道重要的屏障。皮肤屏障功能是由表皮角质形成细胞终末分化形成复层鳞状上皮来实现的。本研究的主要研究内容就是克隆和鉴定调节角质形成细胞终末分化的转录因子，以及参与皮肤屏障功能的蛋白酶，蛋白酶抑制剂和细胞因子。我们采用了全转录组测序的方法比较了不同分化阶段的角质形成细胞的全转录组表达谱，找出了在终末角质形成细胞上调幅度最大的前十位基因，并对其中的五个尚未研究的基因FOXN4，MKX，MSC，NFE2和FOXC1进行了基因表达验证和初步功能研究。我们发现FOXC1的蛋白表达水平在皮肤表皮的分化程度高的颗粒层细胞中显著增加，其表达在皮肤附属器毛囊内层细胞和汗腺导管细胞中也显著增加。FOXC1的表达缺陷导致所有晚期终末分化基因的表达下调，包括所有表皮分化基因区的基因，参与角化的基因，参与鞘脂和神经酰胺代谢的基因，和表皮特异性细胞间粘着基因。FOXC1受转录因子ZNF750和KLF4的调控，而其本身又调控GRHL3。因此我们的研究发现了一个新的参与调控表皮角质形成细胞分化的转录因子，其作用在ZNF750和KLF4的下游，GRHL3的上游。根据表达FOXC1的细胞类型推测，其也可能参与了人类皮肤附属器毛发和汗腺的发育。通过基因敲低实验， 我们发现敲低FOXN4 导致表皮棘层标志物角质蛋白10（KRT10）的显著下调，而终末分化产物involucrin 和loricrin 显著上调。FOXN4表达缺陷的角质形成细胞在体外器官培养中也不能形成正确的角质层。这些结果表明FOXN4可能参与了表皮角质形成细胞的分化过程。我们发现NFE2能被白介素4显著诱导，敲低该基因的表达导致终末分化基因标志显著上调， 表明该基因可能参与终末分化的负反馈调节。除了寻找参与终末分化调节的转录因子之外，我们还对糜蛋白酶抑制剂SERPINA3，蛋白酶KLK7 和角质细胞特异产生的I型干扰素IFN-κ与皮肤慢性炎症性疾病银屑病进行了一系列的研究，以寻找银屑病防治的分子靶点。这些基因产物在银屑病皮损中异常增加的分子机制，是否参与疾病的进展还需进一步研究。