Shh-Gli1-DNMT1在骨髓增生异常综合征恶性克隆演变中的功能机制研究

Myelodysplastic syndromes (MDSs) are clonal disorders of hematopoietic stem cells (HSCs) characterized by ineffective hematopoiesis that leads to refractory cytopenias with increased risk of transformation to acute myeloid leukemia (AML).During the progession of MDS to AML,We found that Gli1 gene were up-regulated,corresponding with the overexpression of DNMT1 gene.Blocking Shh-Gli pathway can down regulate DNMT1 expression,and reverse the tumor-suppressor gene such as P15,DAPK gene expression.The expression of Gli1 gene in MDS cells is also regulated by the marrow stromal cells involving shh signaling pathway.Our results indicated that the Gli gene may control MDS malignant cloning evolution through the methylation mechamism by targeting DNMT1. We are planning to explore the gene fuction of Gli1 in MDS cells based on the methods of gene transfection via in vivo and vitro experiments;and using dual luciferase report gene technology to explore the mechanism of Gli1 regulating tumor suppressor gene CpG promoter CpG island methylation through DNMT1; finally, we will establish the transwell coculture system to explore the fuction and mechanism of MSCs regulating Gli1 transcription in MDS cells. Our research might provide a new strategy for targeting MDS malignant clonal development.

本课题组研究发现，骨髓增生异常综合症(Myelodysplastic Syndromes,MDS)恶性克隆演变过程中Gli1基因表达逐渐上调，伴随着DNA甲基转移酶DNMT1的过表达；阻断Shh-Gli1通路可抑制DNMT1表达，实现抑癌基因的功能恢复。表观遗传有一定可塑性，其发生可能受病理造血"龛"调控。鉴于MDS肿瘤细胞Gli1的表达受shh/patched复合物介导的造血干细胞与"龛"之间的对话调控，我们推测MDS恶性演变中可能存在Shh-Gli1-DNMT1新型信号途径。本研究拟采用基因转染调节MDS细胞Gli1表达，通过体内外实验研究其功能；利用双荧光素酶报告基因等技术，探索Gli1调控DNMT1及抑癌基因启动子CpG岛甲基化的作用机制；原代培养MDS的MSC细胞，模拟骨髓"龛"，探讨骨髓"龛"对Gli1转录的启动机制。项目研究获得结果可为MDS恶性克隆演变的靶向治疗提供新策略。

主要研究背景及目标：异常激活的Hh信号与多种肿瘤的发生发展密切相关，越来越多的证据表明Shh-Gli信号通路的不恰当激活将导致细胞恶性克隆转变。本研究通过临床样本检测，探讨Shh(Sonic Hedgehog)信号通路的异常活化在骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome,MDS) 发生发展中的作用；通过研究MDS中Shh信号对DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)的调控作用探讨Shh信号在MDS中的作用机制；同时研究骨髓微环境中的Shh信号对MDS发病的作用。.主要研究内容：我们通过收集MDS患者骨髓，分离及培养骨髓原代细胞，定量PCR检测DNMT1及Shh通路相关基因的表达。同时通过共培养观察MDS骨髓基质细胞通过Shh通路对MDS细胞生存的调控作用。通过沉默MUTZ-1中的(Gli1)，观察对DNMT1及抑癌基因P15的基因及蛋白表达影响，同时通过甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术检测MUTZ-1细胞中沉默Gli1对P15基因的甲基化水平的影响。我们发现Shh信号通路在MDS中异常活化且与MDS危险度分级正相关，高危MDS患者骨髓基质细胞可以通过Shh信号促进MDS细胞的生存。DNMT1在高危MDS患者中表达升高，且与Gli1的表达相关。 应用外源性人Shh肽可以促进MUTZ-1的增殖，Cyclopamine可以抑制MUTZ-1的增殖，促进其凋亡；且cyclopamine与去甲基化药物5-aza-dC具有协同作用。ShRNA慢病毒干扰MUTZ-1中的Gli1后，DNMT1表达降低且抑癌基因P15表达部分恢复；沉默Gli1后MUTZ-1中P15的甲基化水平降低，Gli1沉默联合应用5-aza-dC后较单纯应用5-aza-dC该作用更显著。.重要结果及科学意义：本项目首次提出Shh信号通路可能是MDS恶性克隆的关键信号途径。高危MDS骨髓间充质基质细胞可以通过Shh信号促进MDS细胞的增殖，其主要作用机制是通过GLI1-DNMT1信号进而引起抑癌基因P15的过甲基化。该课题将为MDS的进一步靶向治疗提供新的依据。