新的非核糖体肽合成酶基因簇功能研究

芽孢杆菌（Bacillus spp.）是目前生防细菌中研究和应用较多的一类细菌，但由于其主要抑菌活性物质非核糖体抗生素产量不高，限制了这类产品在农业上应用的规模和范围，因此有必要研究这类抗生素合成调控机理。本课题组前期的研究揭示生防芽孢杆菌B3菌株存在一个未知功能的新的非核糖体肽合成酶基因簇。这个基因簇具有典型的非核糖体肽合成酶结构域，采用现有的方法无法预测产物的合成机制以及产物的结构与功能。本研究旨在利用体内遗传学与体外生物化学相结合的方法，阐明新非核糖体肽的生物合成机理，鉴定新非核糖体肽的分子量、结构以及抑菌谱等生物学特性，构建新非核糖体肽高表达菌株。采用的技术手段主要包括基因克隆和表达技术、蛋白纯化技术、基因定点突变技术、大片段基因重组技术、非核糖体肽纯化与质谱鉴定技术等。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是典型的植物根围促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR），也是研究PGPR与植物有益互作的模式菌株。这类细菌能产生丰富的抑菌产物，抑制植物病原物的生长。因此，研究此类细菌的抗菌物质的合成调控机理是该互作领域的一个重要方向，也是此类细菌应用的理论基础。本项目以解淀粉芽孢杆菌B3菌株未知功能非核糖体肽基因簇（non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs）作为研究对象，探索该基因簇的生物学功能及合成产物，目前已经取得以下研究研究进展和结果。（1）成功克隆和表达了该NRPSs中6个A domain片段，并得到了高纯度的重组蛋白。（2）建立了ATP-PPi 交换实验技术体系，利用放射性P32，检测A domain的酶学活性，现已经确定了这6个A domain的特异性底物，初步确定该基因簇所合成产物的肽链部分结构为L-Cys---L-Cys---Gly---L-Cys---L-Ala---L-Lys---L-Asn。（3）成功克隆和表达了该基因簇中的两个修饰基因，并纯化得到了高纯度的蛋白，现正在进行酶学活性的分析。（4）建立了放射性底物标记法和酵母TAR克隆技术，为后续从体内遗传学的角度，验证先前体外活性的研究结果，最终揭示产物的真正结构提供了保障。（5）鉴定到解淀粉芽孢杆菌产生的非核糖体二肽Bacilysin能通过作用于细胞壁抑制蓝细菌的生长，还采用无标记基因工程技术，提高了菌株的Bacilysin产量和生防活性。另外，在本项目的资助下，项目主持人在国内外期刊上发表论文10篇，其中在Appl Environ Microbiol和Appl Microbiol Biotechnol各发表一篇共1作者论文；获得授权发明专利2项。