蔗糖合成酶在葡萄果实发育中的功能研究

Development and regulation on fruit quality is an important work in fruit research area. The sucrose plays very important roles during the development of fruit, and sucrose synthase (SS), a key enzyme in the sucrose metabolic pathways, involves in both synthesis and decomposition of sucrose. However, there are rarely detailed reports about how sucrose synthase regulates the sucrose metabolism in, and involves in the development of grape berry. In this project, we will study, at physiological and molecular biological levels, the following: The influence of sucrose and sucrose signal on the growth and development of grape; the distribution of sucrose synthase activity at different grape berry developmental stages and its day-night rhythm situation; analysis of the influence both of external and internal factors on the activity of sucrose synthase in vivo and in vitro; analysis of the function of the synthesis and decomposition activities of SS during grape berry development; analysis of the active locus of SS with technology of prokaryotic expression, function analysis with tomato transgenic, and analysis of the proteins acted with SS using yeast two-hybrid system. The results from this project will definitely do great help to our understanding the mechanism that sucrose synthase involves in the development of grape berry and quality formation, and provide us the theoretical basis for better regulation of berry quality.

果实发育和品质调控是果树研究领域的重要工作，而蔗糖代谢在果实发育中起着重要的作用。蔗糖合成酶是蔗糖代谢路径中的一个关键酶，具有合成和分解蔗糖两方面的功能，但是目前未有关于蔗糖合成酶在葡萄果实中如何调控蔗糖代谢进而参与果实发育的报道。为此，本项目拟在生理及分子水平上研究: 蔗糖和蔗糖信号对果实发育的影响；不同发育阶段和昼夜周期葡萄果实蔗糖合成酶的活性分布特点；在活体与离体条件下分析外界因素对果实中蔗糖合成酶活性的影响；分析蔗糖合成酶的合成和分解方向在果实发育不同阶段的功能；进一步通过原核表达蔗糖合成酶活性位点分析、番茄转基因功能验证和酵母双杂交分析互作蛋白等技术，阐述葡萄蔗糖合成酶的功能。本研究的开展与完成有助于认识蔗糖合成酶在葡萄果实发育和品质形成中的作用机理，为更好地调控葡萄果实品质提供理论依据。

蔗糖合酶是植物糖代谢过程中的一种关键的限速酶，在植物的呼吸、碳水化合物的生物合成及利用等过程中发挥了重要的作用。利用生物信息学鉴定出葡萄中5个SS基因家族成员；利用基因结构比较、共线性分析以及系统发育分析等方法，发现VvSS1/VvSS5、VvSS2/VvSS3和VvSS4起源于3个古代SS基因，全基因组重复事件导致了SS基因家族成员的增加；qPCR和芯片数据表明VvSS基因具有不同的时空表达模式。.克隆了VvSS3基因并进行原核表达，利用纯化的蛋白进行体外孵育实验，确认了蔗糖合酶的分解活性起主要作用。.VvSS3转基因烟草植株中基因表达、酶活性、叶绿素含量、果糖和葡萄糖含量显著升高，蔗糖含量显著降低，纤维素含量增加和木质素含量降低，表明VvSS3在将蔗糖分解成UDP-葡萄糖和果糖以促进纤维素合成的过程中起着重要作用，并且抑制了木质素的生物合成。利用扫描电子显微镜发现转基因烟草中次级细胞壁厚度显著增加。表明VvSS3在与分解蔗糖与纤维素生物合成有关的生物通路中起着重要作用。酵母双杂交筛选出与VvSS3互作的蛋白SnRK1并进行了BiFC验证。.SS活性随果实发育不断升高，且分解活性远大于合成活性；NaCl、HgCl、Ca2+等理化因子显著抑制了SS分解和合成活性，导致糖含量降低；GA、JA、ETH等理化因子则促进了SS分解活性，促使葡萄糖和果糖含量升高；ETH、K+、NH4+则促进了SS合成活性，蔗糖含量升高；温度和湿度等生态因子对SS分解和合成活性的作用不明显；pH明显抑制了SS分解和合成活性，导致糖含量降低；蔗糖处理使SS分解活性显著升高，葡萄糖和果糖处理则显著促进SS合成活性。上述结果说明激素、金属离子、温度、湿度、pH等不同因子通过改变SS催化反应向分解方向或者合成方向的移动而调控SS分解活性和合成活性的分布，从而影响了果实的糖积累。