长链非编码RNA HOTTIP调控HOXA13在瘢痕疙瘩形成中的作用及其分子机制研究

Keloid is a benign dermal tumor characterized by invasive growth and postoperative recurrence with histological accumulation of fibroblasts and excessive deposition of extracellular matrix. As involving multi-factor regulation and signaling transductions, the forming process is complex and there is currently no effective prevention and control measures. LncRNA have emerged as key components of genomic imprinting, chromatin remodeling and transcriptional regulation with the characteristics of highly conserved sequence components, diverse secondary structure and distinctive subcellular localization. LncRNA HOTTIP could regulate the expression of multiple 5’-HoxA genes by combining PRC2 or WDR5/MLL complex, facilitating H3K4me3 and activing transcription. Our preliminary experimental data show that HOTTIP is overexpressed in keloid, promotes the proliferation of keloid fibroblasts and alteres cell cycle-related proteins. Furthermore, HOXA13 is coordinately high expressed with HOTTIP, while knocking-down HOXA13 expression could promote cell apoptosis and alter cell cycle through PI3K/AKT signaling pathway. Therefore through the interactions between proteins and RNA, we shall study the influence of HOTTIP by regulating HOXA13 on keloid fibroblasts cell phenotype, explore potential downstream targets. We expect to unravel the underlying mechanisms and discover a new molecular target for multi-target prevention and treatment of keloid.

瘢痕疙瘩作为多因素参与多因子调控的疾病，具有浸润性生长及术后易复发的特点，被称为良性真皮肿瘤，目前尚未找到有效的防治措施。LncRNA具有序列元件高度保守、空间二级结构多样等特点，参与基因印记、染色质重塑及剪接调控等过程；已有文献报道LncRNA HOTTIP可通过结合PRC2或WDR5/MLL复合物促进H3K4me3，激活HOXA簇基因的翻译转录。本课题预实验数据显示，HOTTIP在瘢痕疙瘩中表达上调，促进成纤维细胞增殖，改变周期相关蛋白表达，且与HOXA13协同增高，敲减HOXA13可通过PI3K/AKT通路使成纤维细胞周期阻滞、凋亡增加。故本课题拟在分子水平通过蛋白质与RNA间相互作用研究，结合临床样本检测探索HOTTIP通过调控HOXA13对瘢痕疙瘩成纤维细胞表型的影响，及相互作用的分子机制，揭示HOTTIP/HOXA13调控通路的分子机理，为瘢痕疙瘩的防治提供新的靶点及理论依据。

瘢痕是皮肤创伤愈合过程中组织自身修复的产物，而过度修复将导致病理性瘢痕的形成，后者主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，会造成患者外形的毁损和程度不等的功能障碍。本课题组明确了长链非编码RNA HOTTIP与同源盒基因HOXA13的表达关系，分别完成两者在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的调控作用。临床采集样本瘢痕疙瘩70例，增生性瘢痕15例。瘢痕疙瘩患者血清标本配对采集28例，增生性瘢痕患者血样10例，经免疫组化及qPCR显示，发现瘢痕疙瘩HOXA13表达均呈阳性，HOTTIP表达升高，两者呈正相关。在增生性版瘢痕组织中，HOXA13及HOTTIP表达增强不稳定，推断表达强度与瘢痕成熟阶段有关。血样分析HOXA13及HOTTIP在三组中表达均无明显差异，提示HOXA13及HOTTIP仅在组织中表达差异明显，但无法通过血液检测作为筛查手段。细胞功能学实验表明敲减HOTTIP及HOXA13后，成纤维细胞实验组与对照组的增殖、DNA复制、周期、凋亡等细胞功能学实验均差异明显。HOTTIP/HOXA13直接作用位点尚未实验验证成功。大鼠创面愈合模型观察到经HOXA13处理后创面愈合明显加快，尤其在第6天后较为明显，愈后瘢痕不明显；TGFβ1与HOXA13表达变化一致，具有升高-回落-升高的的趋势，推测两者存在一定的潜在联系；而Smad2虽缓慢升高，但前期两组表达具有差异后期基本一致，提示可能与前期HOXA13激活Smad系统而愈合后期通过非Smad通路进行调控，另外动物实验需要进一步重复实验验证。总体而言，实验大部分顺利完成，但有关通路机制部分与预期略有差异。实验结果提示HOTTIP/HOXA13存在组织差异，但无法作为临床筛查指标使用，两者在瘢痕愈合过程可能通过非Smad2通路进行调控，虽然本课题切入点是瘢痕疙瘩的治疗，但此结果为后期的“创伤瘢痕愈合最小化”的研究提供了思路。