新型细胞膜靶向型钙离子区域荧光探针的设计合成及分析应用

钙离子参与细胞几乎所有生理过程，质膜钙泵作为钙离子排出细胞的主要途径，其相关检测对钙离子生理作用研究具有重要意义。荧光探针由于具有灵敏度高、选择性好、易实现原位可视化分析等优势，在钙离子研究中得到广泛应用。然而，已有的荧光探针多用于细胞内钙离子检测，难以用于细胞钙离子外排和质膜钙泵活性分析。本项目拟将钙离子荧光探针和细胞膜探针相结合，以1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N,N,N',N'-四乙酸（BAPTA）为钙螯合基团，以BODIPY为荧光团，以长链烷基、磷脂和N-羟基琥珀酰亚胺活性酯为细胞膜标记基团，设计并合成细胞膜靶向钙离子区域荧光探针，构建针对活细胞钙离子外排及质膜钙泵活性的可视化分析新方法，并用于探索质膜钙泵活性变化在神经细胞衰老中的作用机制。本研究不但为钙平衡、质膜钙泵活性及生理作用研究提供新的工具，也为细胞与周围环境物质交换的相关分析提供新的思路，具有重要理论意义和研究价值。

钙离子参与细胞几乎所有生理过程，但钙离子仅由单个原子组成，难以生成和消灭，其生理作用只能依赖浓度变化实现。质膜钙泵作为钙离子排出细胞的主要途径，与细胞钙离子浓度调节密切相关，其相关检测对钙离子生理作用研究具有重要意义。荧光探针由于具有灵敏度高、选择性好、易实现原位可视化分析等优势，在钙离子研究中得到广泛应用。然而，已有的荧光探针多用于细胞内钙离子检测，难以用于细胞钙离子外排和质膜钙泵活性分析。本项目将钙离子荧光探针和细胞膜探针相结合，设计并合成细胞膜靶向钙离子区域荧光探针，构建针对活细胞钙离子外排及质膜钙泵活性的可视化分析新方法，研究内容及取得的成果如下：(1)设计并合成基于钙离子识别基团1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)、二氟化硼二吡咯甲烷(BODIPY)和长链烷基的多种钙离子荧光探针，包括1,3,5,7-四甲基-8-BAPTA-二氟化硼二吡咯甲烷(TMB-BAPTA)、1,3-二甲基-5-十六烷基-8-BAPTA-二氟化硼二吡咯甲烷(DMHB-BAPTA)、1,3,5,7-四甲基-2,6-双十六烷基-8-BAPTA-二氟化硼二吡咯甲烷(TMDHB-BAPTA)和二甲基二苯乙烯基-BAPTA-二氟化硼二吡咯甲烷(DMDVHB-BAPTA)，并研究了它们的性质和细胞膜靶向能力。(2)将细胞膜靶向型荧光探针设计理念扩展到其它金属离子和气体信号分子，设计并合成相应的细胞膜靶向型荧光探针，包括NO探针1,3-二甲基-2,6-二磺酸钠-5-十六烷基-8-(3’,4’-二氨基苯基)-二氟化硼二吡咯甲烷(DSDMHDAB)和最近设计的铜离子探针DMHB-BPMEA，其中DMHB-BPMEA与铜离子络合后荧光猝灭，其络合物还可作为细胞膜靶向性的硫化氢荧光探针。(3)荧光成像在准确定量分析方面普遍存在不足，细胞膜靶向型荧光探针也不例外，难以对穿过细胞膜的目标物进行准确定量。为此，我们尝试设计具有优异水溶性的荧光探针，该探针不会穿过细胞膜，以毛细管为微反应器，结合毛细管电泳分离激光诱导荧光检测，可对细胞释放出胞外的目标物进行准确定量。