鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白与宿主细胞(THP-1)蛋白相互作用的研究

Salmonella is a facultative endopathogen and the causative agent of various animals and human diseases ranging from enteritis to typhoid fever.S. typhimurium is a leading cause of human gastroenteritis, making it one of the most serious zoonoses. In many tissues macrophages constitute the first line of defense of the innate immune response against invading microorganisms.The ability of Intracellular survival and multiplication within mammalian cells is necessary for persistence infection.The underlying molecular mechanisms of the Salmonella-host cells interaction are largely unknown.Therefore, we should venture deeper in the study of the pathogen-host interactions to understand the pathogenic molecular mechanism. In addition to bacterial EF-Tu's role in protein synthesis, it has been linked to many "moonlighting" roles. EF-Tu has been shown to be concerned in various important cellular processes or disease, including signal transduction, translational control, apoptosis, and cytoskeletal organization.To evaluate the potential role of Salmonella EF-Tu in intracellular survival and multiplication within host cells, we fist use immunofluorescence technique, observation by confocal laser scaning microscopy(CLSM), to identify the distrution and localization of EF-Tu protein on S. typhimurium membrane surface, and then employ yeast two-hybrid system, yeast surface display, GST pull down and Co-Immunoprecipitation methods, systematically screening and identification EF-Tu interacted host cells (THP-1) proteins. Home and abroad，there is no report about interactions between EF-Tu and host proteins.This work will provide new insight into the molecular mechanism of Salmonella EF-Tu in intracellular survival and multiplication within host cells.

沙门氏菌的胞内寄生能为菌体提供一个安全稳定的寄生繁殖环境，这与其能在机体持续存在具有一定的关联性。深入开展沙门菌-宿主细胞相互作用的研究,对阐明沙门氏菌致病的分子机制具有重要的意义。最近研究表明，细菌EF-Tu蛋白是一种多功能蛋白，而不仅仅是作为蛋白翻译因子起作用，而且更重要的是EF-Tu参与许多重要的细胞和疾病过程。因此，为研究细菌EF-Tu蛋白在病原-宿主相互作用中作用，首先采用免疫荧光技术对鼠伤寒沙门氏菌EF-Tu进行亚细胞定位，确定EF-Tu是否存在于菌体细胞表面；同时结合酵母双杂交、酵母表面展示、GST沉淀实验和免疫共沉淀技术，系统地筛选鉴定与EF-Tu相互作用的宿主细胞（THP-1）蛋白。查新表明，国内外尚无关于与病原菌EF-Tu相互作用宿主蛋白的研究报导，这一课题对于探究EF-Tu蛋白在沙门氏菌甚至其他胞内寄生致病菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制有重要意义。

沙门氏菌是一类对人和畜禽健康构成极大危害的革兰氏阴性致病菌，其中鼠伤寒沙门菌的感染率居沙门菌感染的首位，在世界范围内是一种常见的食品污染源。目前，细菌EF-Tu 蛋白已被证实具有多种生物学功能，在多种菌属中均具有诱导宿主免疫应答的能力。提出假设：在鼠伤寒沙门菌感染宿主过程中，EF-Tu有可能作为一种重要的免疫原被宿主细胞所识别和捕获，在细菌与宿主细胞之间发挥作用。.鼠伤寒沙门菌对小鼠的致病机理以及机体对鼠伤寒沙门菌的防御机制了解较多，而在人体内、体外研究较少，为进一步了解鼠伤寒沙门菌对人体的致病机制，本研究将鼠伤寒沙门菌 EF-Tu 蛋白作为“诱饵”，人单核吞噬细胞（THP-1）作为宿主，运用GST-pull down方法筛选出与 EF-Tu 相关联的细胞蛋白，并进行验证，以开展沙门氏菌—宿主细胞相互作用的研究，为阐明沙门氏菌致病分子机制提供依据。首先，以EF-Tu MAb / PcAb 为工具，依次完成间接免疫荧光实验、流式细胞仪分析和补体中和试验对EF-Tu进行定位，结果发现EF-Tu 存在于鼠伤寒沙门氏菌菌体表面。其次，以宿主细胞蛋白与纯化后的EF-Tu蛋白共孵育，设立对照组。洗涤，除去杂蛋白后，从GST Resin上洗脱，获得蛋白复合物，SDS-PAGE电泳分析。结果发现凝胶中多出两条蛋白条带。将凝胶中的蛋白质样品送去公司进行质谱测序，反馈信息得到两个蛋白，即pkM2 和 eEF1α1。然后， 验证EF-Tu与两种细胞蛋白存在相互作用。将新鲜的EF-Tu蛋白分别与纯化后的His-pkM2 和His-eEF1α1共孵育，设立对照组。结果发现：DAB显色后，PVDF膜上显出特异性条带，而对照组呈阴性反应。随后构建pDsRed1-N1-tufA并转染Hela细胞，以IFA检测显示：EF-Tu蛋白在细胞内成功表达。设立两个转染组，完成后对Hela细胞内的pkM2、eEF1α1蛋白分别进行荧光染色，于激光共聚焦显微镜观察。结果表明，EF-Tu蛋白与pkM2、 eEF1α1蛋白分别共定位在细胞质，这在空间上为两者发生联系提供佐证。再次检测pkM2 和 eEF1α1 表达量变化。结果发现随着鼠伤寒沙门菌侵染细胞的时间增加，pkM2和eEF1α1的表达量减少。