池蝶蚌体液免疫因子——铁蛋白Ferritin家族免疫功能分析

池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)属软体动物门，生长快，形态结构更适于育珠。课题组对池蝶蚌基本免疫机制做了初步研究：对池蝶蚌血细胞进行分类、研究了池蝶蚌血细胞吞噬活性；已成功构建噬水气单胞菌诱导的血细胞cDNA文库，并筛选到体液免疫因子铁蛋白Ferritin 1和Ferritin 2，已纯化两个铁蛋白亚基。在前期工作基础上，本项目将对铁蛋白家族进行免疫功能分析：继续筛选具有免疫功能的铁蛋白Ferritin基因家族，纯化铁蛋白，制备单克隆抗体。采用Genome Walker法对铁蛋白进行启动子克隆及功能分析，有害微生物刺激、环境因子胁迫、育珠手术损伤池蝶蚌后，采用Real time-PCR法、免疫组织化学及免疫荧光技术、显微镜技术、贝类血细胞体外培养技术及RNAi干扰技术研究铁蛋白是否会发挥免疫调节作用以及如何发挥免疫作用,为提高池蝶蚌自身的免疫能力等提供依据。

我国淡水育珠贝受到种质退化、疾病威胁、发病率高，池蝶蚌自1997年引进至今未见疾病报道。为预防病害发生，本课题开展了池蝶蚌铁蛋白基因家族克隆及免疫功能分析，取得如下研究成果：（1）铁蛋白HsFer-1、HsFer-2cDNA全长分别为760bp和877bp，均为脊椎动物铁蛋白H亚基家族成员，制备兔HsFer-1和HsFer-2多克隆抗体。（2）HsFer-1和HsFer-2mRNA在肝胰腺中表达最高，在血细胞中表达最低。（3）与对照组比，嗜水气单胞菌诱导后，HsFer-1mRNA在肝胰腺、性腺和血细胞中表达显著上调，其峰值分别为2.47倍、9.59倍和1.37倍。HsFer-2在性腺中升高到4.87倍，而在肝胰腺和血细胞中分别下降至0.52倍和0.57倍。金黄色葡萄球菌刺激后，HsFer-1在3种组织中表达上调，峰值分别为2.82倍、7.69倍、1.80倍。HsFer-2表达峰值分别为2.34倍、2.25倍、1.80倍。鳗弧菌刺激后，HsFer-1/2的表达也出现一定的上调。（4）与对照组比，Cu2+刺激后，HsFer-1在血细胞、性腺中的峰值分别为9.37倍和9.61倍，在肝胰腺中，其表达水平无显著变化。HsFer-2在血细胞和性腺中峰值分别为3.65倍和12.64倍。Pb2+刺激后，在肝胰腺和性腺中HsFer-1峰值分别为1.76倍和4.16倍；HsFer-2的表达峰值为2.61倍和4.02倍。Fe3+刺激后，在血细胞、肝胰腺和性腺中HsFer-1的表达峰值是1.53倍、6.14倍、2.74倍；HsFer-2的表达峰值是3.59倍、4.29倍和10.1倍。人工插核后，HsFer-1/2在斧足中的表达无显著性变化，血细胞中表达量分别下降到0.08倍和0.13倍。性腺中，HsFer-1/2的表达量峰值达到1.80倍和6.46倍。（5）重组铁蛋白可抑制细菌生长，抑菌效果随蛋白浓度升高而增强。其与Fe3+螯合后，抑菌效果减弱。（6）体外培养池蝶蚌血细胞可稳定存活24h；沉默HsFer-1，HsFer-1表达水平下调，而HsFer-2的表达水平出现上调，推测铁蛋白两个亚型之间存在功能互补。（7）HsFer-1/2蛋白均定位于肝胰腺细胞膜。铁蛋白定位于血细胞的细胞核中。因此，池蝶蚌铁蛋白HsFer-1和HsFer-2基因，在池蝶蚌免疫调节中发挥重要功能，且两者具互补作用。