柑橘裂皮类病毒与寄主互作的分子机理研究

柑桔裂皮类病毒是严重危害柑橘生产的四种主要致病因子之一，基于株系差异导致柑橘表现不同程度的矮化、树径减少、裂皮等危害症状。关于该类病毒如何导致寄主产生这些症状及不同株系怎样引起轻重不同的症状等与寄主互作的分子机理尚不明确，探明其与寄主互作的分子机理对于明确其致病机制从而发掘有效的防治方法具有显著意义。由于该病原结构简单（约371nt长的无蛋白外壳RNA分子），直接通过其RNA与寄主互作致病，影响到的寄主基因相对有限，易于对这些基因进行筛选和功能分析及验证。本研究拟运用抑制消减杂交技术，分析该类病毒强毒和弱毒株系侵染柑橘后对其基因表达的影响，筛选出柑橘与该类病毒特异性互作的靶标基因及病程相关基因，并对这些基因的表达特点、相互关系、与株系及症状间的关系分析，明确该类病毒与寄主互作的分子机理，并有望获得柑橘生长调控等的相关基因信息，为有效防治该类病毒病害及柑橘品种改良提供可利用资源和技术支持。

本研究以来源于表现裂皮症状柑橘样品中所获柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid, CEVd）分离物的四个分子变种CEVd.01、CEVd.03、CEVd.04和CEVd.08为试材，其中，CEVd.01具有强毒株系分子组成特征，其它克隆具有弱毒株系分子构组成特征。将四个克隆分别构建二聚体cDNA克隆、带粘性末端的cDNA单聚体和单聚体RNA接种番茄，进行侵染性评价和致病力测定，结果显示仅二聚体和带粘性末端的cDNAs具有侵染活性；接种成功的番茄植株对比未接种植株表现显著的矮化效果，四个分子变种接种植株矮化程度表现出不显著差异。为此，将CEVd.01二聚体cDNA体外转录成RNA后接种枳壳，接种成功后与毒源植株间隔一个月分三个时间点采用柑橘基因芯片进行接种植株的表达差异分析，结果显示CEVd侵染后引起枳壳基因表达水平的显著改变，而毒源材料相关基因的表达改变水平明显强于接种材料；其中上调基因主要涉及植物防御信号途径相关基因；下调基因主要包括糖类（纤维、果胶、木糖等）、蛋白（微管蛋白、伸展蛋白、成束蛋白等）、激素（乙烯、赤霉素和烟酰胺）、细胞色素、氧化还原酶、过氧化物酶和几丁质酶等代谢相关基因。通过半定量RT-PCR对候选下调基因的表达情况间隔一个月分三个时间点进行了验证。其中，烟酰胺合成酶参与植物生长及铁离子代谢途径，与CEVd侵染导致柑橘矮化和缺铁性黄化症状吻合，预测为CEVd致病关键基因。而其它下调基因包括纤维、木糖苷酶、果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、微管蛋白、伸展蛋白、成束蛋白等参与细胞壁建成，预测在CEVd引起寄主裂皮过程中起重要作用。本研究鉴定了与CEVd侵染相关的基因表达特征，为进一步明确CEVd的致病机理奠定了基础。