基于PI3K/Akt信号通路探讨天麻抗心肌缺血药效物质与作用机制

Based on the research of the anti myocardial ischemia part of of gastrodia elata and its main biologica activity, this project will carry out the chemical study of the effective part of gastrodia elata, adopting the systemic separation and tracking separation by LC-MS to obtain the monomer compound and identifying the structure by NMR spectrum, meanwhile study on the constituent migratint into the blood of the effective part of gastrodia elata and testify the bioactivity, finally determine the effective constituent of anti myocardial ischemia of gastrodia elata. After the above research, we further investigate the influence on the Cellular inflammatory factors IL-6、IL -1β、TNF-α and apoptosis protein Bcl-2、Bax、Capase-3 and the change of the protein PI3K、Akt、GSK-3β in the PI3K/Akt signaling pathway, exploring the relevance of effective constituent and bionactivity and activity mechanism and illuminating the effective constituent and mechanism of anti myocardial ischemia of gastrodia elata. The rusults of this project would deepen the comprehension of the effect of gastrodia elata and enrich the content of traditional Chinese medicine and lay the foundation for the study on new drug of anti myocardial ischemia and provide the basis for making full use of the rich sources of gastrodia elata.

在已确定天麻抗心肌缺血有效部位及其主要生物活性的基础上，本项目拟对其有效部位进行系统的化学研究，采用系统分离与液相质谱追踪分离相结合的方法获得单体成分，采用波谱学测试技术确定单体化合物的化学结构，同时对有效部位的体内移行入血成分进行研究，并结合药效学研究确定天麻抗心肌缺血有效成分。在此基础上，考察有效部位、有效成分二个层次药效物质对IL-6、IL -1β、TNF-α等心肌炎症因子以及相关凋亡因子Bcl-2、Bax以及Capase-3蛋白的影响，检测PI3K、Akt细胞信号通路中PI3K、Akt及其下游靶点蛋白GSK-3β表达的变化，探讨有效部位/有效成分↔功效(药理作用)↔作用机制的相关性，阐明天麻抗心肌缺血的药效物质及其作用机制。本项目研究可深化对天麻功效的科学内涵的认识，丰富中医药学内容，并可为研制出疗效好、具有自主知识产权的抗心肌缺血新药，充分利用天麻丰富的资源提供重要的科学依据。

本项目应用大鼠MCAO动物实验模型，明确天麻抗心肌缺血有效部位生物活性，在此基础上，对天麻有效部位进行系统的化学研究，采用系统分离方法从天麻有效部位中分离鉴定出33个化学成分，其中8个未见文献报道的新化合物。同时采用液相质谱追踪分离方法从天麻有效部位中鉴定出64个化学成分，其中潜在的新化合物15个，并追踪分离得到3个新成分。结合相关文献，应用液相质谱联用技术对天麻川芎药对体内移行入血成分进行研究，从其大鼠血浆样品中鉴定出入血成分64个，其中7个原型成分，57个代谢产物，其主要代谢途径为羟基化、葡萄糖醛酸化与硫酸化等。应用代谢组学技术对天麻抗缺血性脑卒中以及天麻钩藤药对治疗偏头痛的机制进行探究，发现天麻主要通过影响包括嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、精氨酸代谢、脯氨酸代谢在内的七条代谢通路，发挥治疗大鼠脑缺血再灌注损伤作用；而天麻钩藤药对主要通过影响亚油酸代谢，色氨酸代谢，精氨酸代谢，谷氨酸代谢，甘油磷脂代谢，酪氨酸代谢，烟酸和烟酰胺代谢等发挥治疗偏头痛效果。最后采用大鼠心肌细胞H9c2缺氧复氧模型，应用MTT法筛选8种巴利森苷类成分的活性，选出活性最好的单体化合物；再经Tunel法检测细胞凋亡；流式细胞仪检测细胞凋亡率；免疫共沉淀和Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、Cytochrome C等相关凋亡因子以及JNK信号传导通路相关蛋白JNK、c-jun、ATF-2、14-3-3以及14-3-3与Bax结合的变化情况，结果显示：Parishin J预处理细胞可以通过下调JNK1、c-jun、ATF-2和14-3-3磷酸化水平并促进14-3-3与Bax结合从而减少H9C2细胞保护缺氧复氧导致的损伤。本项目研究可深化对天麻抗心肌缺血、抗缺血性脑卒中功效的科学内涵的认识，丰富中医药学内容，为天麻及其复方深入研究奠定基础，为充分利用天麻丰富的资源提供重要的科学依据。