Danon病的小鼠模型构建与基因治疗

Danon disease is a rare X-linked genetic syndrome comprising myocardium, skeletal muscle and nervous system disorders, and with heart failure or sudden death in severe stage. The pathogenesis of Danon disease is mutations in Lamp2 gene leading to glycogen storage in lysosomes.With no effective treatment, Danon disease has a very poor prognosis,and the majority of patients are difficult to survive to middle age.In our previous study,We have successfully created a Knock-in mouse model of Lamp2 gene mutation and the wild-type Lamp2 gene was amplified as well.Based on the previous study,this project intends to use recombinant adeno-associated virus 9(AAV9), with high efficiency of targeting the heart, muscle and nervous system and with long-lasting and safe effect,to deliver the wild-type Lamp2 gene to the myocardium, skeletal muscle and nervous system of the Lamp2 gene knock-in mice to restore the corresponding functions and achieve the goal of alleviating and even curing Danon disease.This study intends to provide evidence for the effectiveness and safety of the gene therapy for Danon disease.

Danon病是一种X染色体连锁遗传的综合征，l临床较罕见，其致病机制为Lamp2基因突变，使细胞溶酶体中糖原贮积，进而导致心肌、骨骼肌以及神经系统病变，严重时出现心脏衰竭或猝死。目前该病尚无有效治疗方式，患者预后极差，绝大多数患者难以存活至中年。本申请面上项目，主要在前期研究中已成功制备了Lamp2基因突变的Knock-in小鼠模型并成功扩增出了人野生型Lamp2基因等基础上，拟利用9型重组腺相关病毒（AAV9）能够高效靶向心脏、肌肉、神经系统且效果持久和安全的特性，对模拟病人遗传背景的含有突变Lamp2基因敲入小鼠，应用AAV9重组病毒进行治疗，将野生型的Lamp2基因递送到小鼠的心肌、骨骼肌和神经系统，以恢复其相应功能，达到缓解甚至治愈Danon病的目的，以期为Danon病这类单基因遗传病的基因治疗提供有效治疗手段和安全性的依据。

Danon病是一种罕见的X连锁显性遗传疾病，由位于X染色体上的溶酶体相关膜蛋白2型(LAMP2)基因突变引起，与严重心肌病、骨骼肌病和精神发育迟缓有关。目前还没有具体的治疗方法，大多数患者将死于室性快速心律失常和进行性心力衰竭。聚簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统是一种功能强大的基因组编辑系统，可以纠正基因治疗中的突变位点。我们的工作是确定通过CRISPR/Cas9系统进行体内基因编辑是否可以治疗小鼠模型中由Lamp2突变引起的Danon病。.我们首先在Danon病患者的LAMP2中发现了一个新的c.741+1 G>T突变，并成功生成了具有Danon病患者心脏肥大和自噬功能障碍等临床特征的同质突变小鼠系。AAV-CRISPR/Cas9被设计用于纠正LAMP2的点突变，并通过心室内注射注入LAMP2 c.741+1 G>T纯合小鼠。经AAV-CRISPR/Cas9处理后，突变位点得到部分纠正，Lamp2蛋白表达部分恢复。与对照组相比，AAV-CRISPR/Cas9靶向单导RNA组的心功能和自噬也有部分改善。.我们的工作证明，CRISPR/Cas9介导的体内基因组编辑可以部分改善LAMP2 c.741+1 G>T纯合子小鼠的心脏和肝脏表型，为修复致病突变治疗Danon病提供了有效的工具。