细粒棘球绦虫EgA31-EgG1y162多价优势表位基因疫苗的筛选和保护机制的研究

Hydatid disease is a serious zoonotic disease in the western pastoral areas in China. The development of new and effective vaccine is one of the main measures to prevent echinococcosis popular. With the development of molecular biology techniques, epitope vaccine is research focus of the molecular vaccine. For the prevention and cure of Xinjiang Echinococcus disease,we build Eg multi-epitope genic vaccine for terminal host dogs, and study the vaccine immune protection. With the method of bioinformatics and phage display choose Eg epitopes . The T-B combined advantage epitopes of terminal host antigens EgA31 and EgG1Y162 are constructed to form pcDNA3.1/egG1Y162-EgA31 multiple antigen genic vaccine using recombinant technology. Immune mouse infection model, specific antibody titers, T lymphocyte proliferative, activity indicators of Th1 and Th2 cells, Th17/Treg cell are detected and explore the characteristics of multiple antigen genic vaccine and the host immune protective effect. On this basis, further immune terminal host dogs with Echinococcus tapeworm ,observed the site protective effect of the vaccine, to evaluate the application prospects, and to lay the foundation for looking for an effective vaccine to control echinococcosis.

包虫病是我国西部牧区的严重的人畜共患病，研制有效的新型疫苗是防止包虫病流行主要措施之一。随着分子生物学技术的发展，表位疫苗成为分子疫苗的研究热点，本研究为预防和根治新疆细粒棘球蚴病，构建针对终末宿主犬的Eg多表位基因疫苗，并研究该疫苗的免疫保护性。方法是利用生物信息学和噬菌体展示技术筛选Eg抗原表位，将终末宿主抗原EgA31与EgG1Y162的优势T-B联合表位, 用基因重组技术构建成pcDNA3.1/egG1Y162-EgA31多价优势表位基因疫苗。同时免疫小鼠感染模型，检测特异性抗体效价、T淋巴细胞增殖反应、Th1/Th2型细胞、Th17/Treg细胞活性等各项指标，探讨多价优势表位基因疫苗的免疫特点和对宿主的免疫保护作用。在此基础上，进一步用细粒棘球绦虫免疫终末宿主犬，观察该疫苗的现场保护效果，评价其应用前景，为寻找控制包虫病的有效疫苗奠定基础。

囊性棘球蚴病(CE)是严重的人兽共患寄生虫病。为了提高疫苗的有效性，将多个抗原进行联合构成多价疫苗，较单抗原疫苗能更好的诱导宿主的免疫保护作用。本研究（1）利用生物信息学技术，通过各种软件的多参数综合预测EgA31和EgG1Y162抗原的基因信息，发现EgA31有 4个B细胞表位和7个T细胞表位，最易形成抗原表位的氨基酸区域为201-534,长度为1002bp；EgG1Y162有2个B细胞表位和6个T细胞表位蛋白T细胞、B细胞表位，序列长度为360bp。（2）通过linker 序列将抗原EgA31和EgG1Y162基因进行连接，扩增联合目的抗原基因，构建原核表达载体Pet30a--EgA31-EgG1Y162，体外诱导、表达、纯化重组蛋白，经抗His标签抗体及20例CE患者血清和20例正常对照组经免疫学鉴定，研究发现His抗体及CE血清患者中18/20例出现阳性反应，该蛋白具有免疫反应。（3）重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，该疫苗的抗体效价为1:512000，初步鉴定该重组蛋白可刺激机体产生较强的体液免疫反应，该重组蛋白具有免疫原性的特点。（4）构建真核表达载体pcDNA3.1-EgA31-EgG1Y162，pcDNA3.1-EgA31，pcDNA3.1-EgG1Y162，经酶切鉴定测序正确，质粒瞬时转染293T细胞，通过Western-blot鉴定其蛋白表达情况，研究发现该目的蛋白在真核细胞中能特定表达。（5）基因疫苗pcDNA3.1-EgA31-EgG1Y162，pcDNA3.1-EgA31，pcDNA3.1-EgG1Y162免疫小鼠，得出其抗体IgG及IgG2a,IgG2b的抗体效价在pcDNA3.1-EgA31-EgG1Y162中最高。细胞因子IL-2，INF-γ,TNF-α的表达，在pcDNA3.1-EgA31-EgG1Y162组中最高。EgA31-EgG1Y162重组基因疫苗不同组的淋巴细胞增，且基因疫苗组增值能力最高。(6)在多价基因EgG1Y162-EgA31疫苗对小鼠的攻虫实验表明，该疫苗具有y一定的免疫保护性。