泛素连接酶E3新一类亚家族成员ZNF313靶蛋白和相关蛋白的鉴定及在T细胞活化免疫调控中的功能研究

2003年，我们首次报道了一个具有新类型锌指蛋白结构域的基因-人ZNF313新基因。近来，与ZNF313具有类似的这一新锌指蛋白结构域的蛋白已被作为泛素连接酶E3新的亚家族报道。对于这一亚家族TRAC-1、RNF138的研究，都显示了这2个基因在泛素化调控过程中的作用。同时，E3在T细胞功能的调控过程中具有十分重要的作用。我们拟在我们前期ZNF313对T细胞活化免疫调控研究及ZNF313蛋白具有结合泛素的活性分析和我们长期在功能蛋白与相关蛋白及靶RNA的鉴定和相互作用研究等工作基础上，进一步通过TAP-LC-MS/MS技术和传统的酵母双杂交实验和细菌双杂交实验结合，确定ZNF313 作为泛素连接酶E3作用的底物靶蛋白和相关蛋白，采用体外和体内泛素化分析、免疫共沉淀、Pull down等方法及ZNF313相关结构域的功能研究，研究ZNF313 在泛素化、T细胞活化免疫调控方面的功能和机制。

本研究中，我们首次报道了RNF166和ZNF313（RNF114）均在T细胞内内源性表达。进一步通过构建完整的ZNF313 和ZNF313结构域缺失突变重组表达质粒，明确了ZNF313及其结构域对T细胞活化具有正向调控作用。RNF114过表达促使T细胞激活效率比提高43%。我们采用类似的研究方法研究RNF166对T细胞活化的调控作用，研究结果表明，RNF166过表达促使T细胞表面早期活化蛋白CD69实现2倍增量。研究相关结构域的调控作用发现，上游C2H2结构域抑制RNF114正向调控，下游C2H2结构域作用与之相反；RING结构域可以抑制RNF166的正向调控。我们通过采用蔗糖密度梯度超速离心实验，首次明确了ZNF313与其家族成员TRAC-1（膜结合蛋白）不同，为非膜结合蛋白。ZNF313 通过泛素化介导其底物蛋白分子的降解，而实现其对T细胞活化的干预。同时，Pull-down结果证实，RNF166可结合Lys48和Lys63多聚泛素链，提示RNF166可能通过“泛素-蛋白酶体” 途径参与T细胞活化；TAP-LC/MS/MS在Jurkat-T细胞共筛选到23种RNF114相互作用蛋白，UniProt分析表明RNF114可能通过这些蛋白参与通过转录及翻译调控、DNA损伤修复、TCR (T cell receptor)信号通路和线粒体融合等途径参与T细胞活化。