广东番茄黄化曲叶病毒AC4寄主互作蛋白的鉴定及功能解析

Results from this lab showed that Tomato yellow leaf curl Guangdong virus（TYLCGuV）AC4 played an important role in viral infection. However, the mechanisms by which AC4 function remain unkown.In this study,yeast two hybrid experiments will be used to identify host proteins interacting with Tomato yellow leaf curl Guangdong virus（TYLCGuV）AC4. The interactions will be confirmed by BiFC and co-IP. The following expriments will be conducted to investigate the relishionships between the interaction and AC4 function: (1) the corressponding host genes will be silenced by TRV mediated virus induced gene silencing (VIGS).Plants with reduced expressions of the genes of interest will be inoculated with TYLCGuV and TYLCGuV-ΔAC4(AC4 null mutation), respectively.The replication and symptom induction of the wild-type and mutant TYLCGuV in the plants will be observed.(2) The sites on TYLCGuV AC4 responsiable for the interaction will be identified.The pathogenicity of corresponding AC4 mutants will be studied using the PVX vector; the cellular localization and silencing suppressor activities of the AC4 mutants will be investigated by transiently expressing them in wild type Nicotiana benthamiana and N. benthamiana 16c respectively.Results of this study will be usful in revealing the mechanisms underlying AC4 function and TYLCGuV-tomato interaction, which undoubtedly will facilitate the development of effective control measures against tomato yellow leaf curl disease.

本实验室已有结果表明，广东番茄黄化曲叶病毒 (Tomato yellow leaf curl Guangdong virus, TYLCGuV)AC4在病毒的侵染中具有重要作用，但其作用机制还不明确。本项目拟通过酵母双杂交实验筛选与TYLCGuV AC4 互作的寄主蛋白，以BiFC和co-IP对候选蛋白与AC4的互作进行验证，利用以下实验研究寄主互作蛋白在AC4功能发挥及TYLCGuV侵染寄主中的作用：（1）以TRV介导的VIGS沉默相应寄主基因，以TYLCGuV/TYLCGuV-ΔAC4（AC4提前终止）进行植物接种，观察病毒致病和复制情况；（2）鉴定AC4与寄主蛋白互作位点，利用PVX及相关瞬时表达载体研究互作位点突变对AC4致病性、细胞定位及沉默抑制子活性的影响。本研究结果将有助于阐明TYLCGuV AC4作用机制及TYLCGuV与番茄互作机理，从而为番茄黄化曲叶病的防治奠定理论基础

番茄黄化曲叶病是全世界番茄生产上最重要的病毒病之一。已有研究表明，番茄黄化曲叶病毒AC4蛋白可能在病毒的致病过程中起重要作用，但其作用机理尚不清楚。本项目构建了野生型及AC4提前终止的番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆，接种实验表明，突变体病毒仍具侵染性，但引起的症状明显变轻，且发病时间显著推迟；突变体病毒在植株中的积累也变慢，但在侵染后期，突变体病毒积累量达到了与野生型病毒相当的水平。这表明AC4可能抑制某种寄主防御反应，加速病毒对寄主的侵染，但并不是病毒复制所必须的。利用酵母双杂交实验筛选到AC4互作候选寄主蛋白45个，并通过双分子荧光互补等实验发现其中3个与AC4存在体内互作：即核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亚基（RBCS），小热激蛋白HSP20和一个Brevis radix-like（BRL）蛋白。通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)沉默RBCS基因沉默后，植株对两种双生病毒，番茄黄化曲叶病毒和苎麻花叶病毒，尤其是后者的感病性明显增强，表现为症状加重和病毒积累量增加。这暗示RBCS蛋白的高水平表达对植物抵御双生病毒侵染具有积极的作用，而AC4与该蛋白的互作可能起到促进病毒侵染的作用。利用细胞共定位实验表明，在单独表达时，AC4定位于细胞膜，但与BRL蛋白共表达时，部分AC4蛋白和BRL一起进入细胞核；荧光定量PCR数据表明番茄黄花曲叶病毒的侵染引起BRL基因的下调。AC4与BRL蛋白在细胞核中的互作可能具有重要的生物学意义。本项目所得数据有助于深入解析番茄黄化曲叶病AC4蛋白的互作机理，为番茄黄化曲叶病防控奠定理论基础。