P-糖蛋白的泛素-蛋白酶体降解及其在难治性癫痫发生机制中的作用

难治性癫痫的发生机制尚未完全明确，P-gp升高是其生物学基础。目前国内外仅从合成角度对P-gp升高的机制作了探讨，而未见从其降解角度开展研究的报道。国外研究及本课题组发现难治性癫痫脑内泛素和ATP降低，预实验发现P-gp被泛素化，但P-gp是否由泛素-蛋白酶体降解，尚需深入研究。本课题拟利用动物和细胞模型两个实验系统，采用免疫沉淀、Western blot、免疫荧光双标及RNA干扰等方法，并结合应用蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂，体外研究神经细胞内P-gp是由泛素-蛋白酶体还是溶酶体降解；在体研究难治性癫痫大脑神经细胞内是否存在P-gp泛素化异常的基础以及P-gp是否被泛素化；体外研究泛素和ATP的改变对P-gp的含量及其功能的影响。结合以上多个方面的验证以期阐明神经细胞内P-gp的降解途径，发现P-gp升高的新机制，进而完善难治性癫痫的发生机制，寻找新的靶点，为难治性癫痫的治疗提供新思路。

难治性癫痫的发生机制尚未完全明确，P-糖蛋白（P-gp）升高是其生物学基础。目前国内外仅从合成角度对P-gp升高的机制作了探讨，而未见从其降解角度开展研究的报道。本研究通过体外和体内实验，采用免疫共沉淀、Western blot、免疫荧光双标及RNA干扰等方法，并结合应用蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂，观察了神经胶质细胞内P-gp的降解途径及其这一降解途径异常与P-gp升高的关系。结果发现：（1）体外人神经胶质细胞内P-gp由泛素-蛋白酶体途径降解。（2）难治性癫痫大鼠脑内与P-gp泛素化有关的泛素、ATP含量均下降。（3）体外RNA干扰人神经胶质细胞的泛素表达及ATP耗竭均可引起P-gp表达升高，同时细胞内抗癫痫药浓度下降。这些研究结果提示，难治性癫痫脑内泛素-蛋白酶体途径异常与P-gp升高有关。P-gp的降解减少是难治性癫痫脑内P-gp升高的机制之一，从而完善了难治性癫痫的发生机制，为难治性癫痫的治疗提供了新的思路。