缺血缺氧脑损伤后神经营养素3诱导神经再生的miRNA机制研究

神经营养素-3（NT-3）通过调节神经干细胞/前体细胞（NSCs/NPCs）的增殖和分化，在神经损伤修复和功能重建中发挥重要作用。有文献报道miRNA参与脑源性神经营养因子的作用过程，但其在NT-3作用中的机制尚不清晰。本研究拟1）以miRNA芯片及实时定量PCR筛选与NT-3作用相关miRNA；2）针对候选miRNA前体分子及其siRNA构建重组慢病毒，感染NSCs/NPCs使目标miRNA在细胞中过表达或被抑制；3）对感染后NSCs/NPCs进行缺氧处理、或移植于缺氧损伤的脑组织片和脑缺血缺氧动物模型，离体及在体水平观察NSCs/NPCs增殖分化情况，分析候选miRNA在NT-3调节NSCs/NPCs增殖分化中的作用和机制。项目意义：探讨NT-3修复神经损伤和功能重建的miRNA机制，筛选脑缺血损伤的miRNA治疗靶分子，为治疗脑血管病，促进损伤后神经再生奠定miRNA的理论基础。

神经营养素3（NT-3）通过促进神经干细胞（NSCs）存活、增殖以及向神经元方向分化，发挥促进神经损伤修复和神经功能重建的作用。有文献认为在NT-3的作用过程中有micro RNA的参与。本研究通过miRNA芯片分析技术筛选参与NT-3功能调控的候选miRNA，以实时定量PCR（RT-PCR）对候选miRNA进行验证，结合文献选定目标miRNA；构建重组慢病毒载体，介导目标miRNA在NSCs内高表达，通过观察NSCs生物学行为变化，分析目标miRNA对NSCs的影响以及与NT-3作用的关系。实验结果证实：以50 ng/ml的NT-3处理体外培养的NSCs，细胞增殖活跃，并以悬浮生长为主；NT-3处理24h及48h后miRNA芯片分析显示共有1455个miRNA表达发生改变，其中最高上调16.4倍，最高下调100倍；结合文献选出10条miRNA作为候选目标进行RT-PCR验证，结果与芯片分析并不完全一致，结合文献选定miR-500、miR-3571以及let-7f作为目标miRNA；构建含有目标miRNA的重组慢病毒，并感染NSCs，重组病毒感染效率可达70%-92%，感染后目标片段表达水平显著上调，与正常培养细胞相比，慢病毒感染后NSCs活力明显下降，但仍保持多向分化能力；与空病毒对照组相比，过表达上述目标miRNA后NSCs细胞活力、增殖状态以及分化能力无显著性差异，但过表达miR-500后细胞增殖指数下降，细胞突起长度增加，β-tubullin III阳性神经元减少。研究结论：（1）NT-3作用后NSCs内多种miRNA表达发生改变，提示在NT-3影响NSCs生物学行为的过程中有miRNA的参与；（2）NT-3（50 ng/ml）作用后miR-500表达水平显著下调，miRNA-3571和let-7f表达明显上调，提示NT-3可能通过改变上述miRNA对其靶标mRNA的负性调控作用，完成对NSCs增殖、分化的影响；（3）慢病毒介导单一miRNA在NSCs内的高表达后细胞活力、增殖以及分化无显著改变，但是高表达miR-500后细胞增殖指数下降、细胞突起长度增加，证实miR-500参与了对NSCs增殖、分化的调控。本研究中改变单一miRNA在NSCs内的表达水平未显著改变NSCs生物学行为，可能与miRNA“一对多、多对一”的作用特点有关。