南极磷虾中不同形态氟的生物毒性及其机制

Antarctic krill (Euphausia superba) is one of the national strategic biological resources to be expolored, because of its huge reservations and high nutrition. However, high fluoride residue in its body limits the ediblity to a great extent, which becomes the key problem to solve for commercial exploitation. Up to now, most studies focuse on the mechanism of fluoride enrichment and its safety evaluation. Little information has been found about how fluoride transfers between its tissues, as well as the tranformation and the toxicity. Therefore, we would analyze the contents of fluoride in different tissues of Antarctic krill, to deeply understand their distribution and existing form .Furthermore, research on the isolation, purification and structure identification of different fluoride samples from antarctic krill would be carried out. At last, the mechanism and biological toxicity of different fluorine from Antarctic krill should be investigated through in vitro studies and animal experiments, toxicity analysis, distribution and transformation regulation on different fluoride by enzymolysis, FPLC and LC-MS/MS analysis. This study will provide critical information on correctly evaluating the safety of fluoride in Antarctic krill and its derivative products, further benifit new commercial exploitation through improving the process and utilization on the resources of Antarctic krill.

南极磷虾（Euphausia superba）蕴藏量大，营养价值高，是我国有待开发的战略性极地生物资源。然而因其高氟问题在很大程度上限制了南极磷虾的食用价值开发，如何科学地评价高氟带来的局限性，成为亟需解决的关键问题。有关南极磷虾中氟的物质形态平衡规律，不同形态氟的毒性及其机制尚未见其报道。本项目首先建立南极磷虾中氟转移的影响参数,研究温度、贮藏期及酶对不同形态氟的转移转化影响，揭示氟的物质形态平衡规律。其次采用酶解技术与红外光谱、薄层色谱、色谱-质谱串联等技术分离不同形态氟样品，研究其在动物体内的迁移转化规律。最后采用体外模拟试验和动物毒理实验，研究不同形态氟的毒性，并从血液、尿液的生理生化指标响应，组织细胞病变特征，脏器系数差异等角度，揭示不同形态氟的毒理效应机制。对建立更合理的氟毒性评价标准，提高我国对南极磷虾资源规模化商业开发具有十分重要的战略意义。

本研究围绕高氟制约南极磷虾食用价值开发问题，系统开展了南极磷虾中氟的物质形态平衡规律、赋存形态及其毒性的相关研究。并取得以下几个方面的研究结果：1）不同贮藏条件对南极磷虾中氟迁移的影响较大，在常温（20℃）12h、冷藏（4℃）28h和冻藏（-20℃，-40℃，-80℃）6个月贮藏过程中，南极磷虾的品质变化对氟的迁移转化较为明显，冻藏可有效控制了氟含量迁移变化。2）采用酶解技术获得了南极磷虾含氟蛋白的最佳酶解工艺，从木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、风味蛋白酶六种生物酶中筛选出胰蛋白酶是酶解南极磷虾的最佳生物酶，并用响应面优化获得最佳工艺（酶解温度45.0℃、酶解时间8.5h，pH7.9，）。3）利用凝胶色谱、液相色谱、质谱分离技术纯化了含氟蛋白酶解产物，将酶解产物通过SDS-PAGE凝胶电泳分析得到酶解多肽的分子量分布。在此基础上，利用Sephadex G-25 葡聚糖凝胶层析柱与高效液相色谱对南极磷虾蛋白肽进行了有效分离，获得了主要的含氟蛋白肽，并利用在线净化液相色谱-四级杆静电场轨道阱串联质谱仪对其进行分子量测定。4）采用蛋白组学鉴定了含氟蛋白的结构。将片段氨基酸序列通过Euphausia superba蛋白质数据库检索，按匹配值得分高于100分可筛选鉴定得到四种蛋白质 (Clock, tropomyosin, ATP synthase subunit 6 (mitochondrion), Hsp70A)，通过对四种蛋白的分析，我们推测南极磷虾蛋白结合氟可能与Clock蛋白的磷酸化有关。5）南极磷虾中氟被ICR系小鼠摄入后的毒性研究，依照食品安全性毒理学评价程序（GB15193.1-2003），以ICR小鼠作为实验动物，通过急性毒性试验确定氟的LD50为177.83mg/kg。用1/5的LD50进行30d喂养试验，结果表明南极磷虾中氟对小鼠虽然不构成明显的急性中毒症状，但对肝脏、肾脏和骨骼造成一定的损伤，长期摄入将会具有潜在的氟中毒风险。