青叶胆繁育系统及遗传多样性研究

The project intends to study the breeding system and genetic diversity of Swertia mileensis T.N.Ho & W.L.Shi, an important medicinal plant species, with principles and methods of reproductive biology, population genetics and molecular biology. .The study will investigate the factors impacted sexual reproduction of S. mileensis. The analysis will be carried out based on sexual system, flowering phenology, pollination ecology, basic breeding system and seed setting characteristics.Genetic diversity and population genetic structure will be estimated by establishing highly polymorphic DNA microsatellite (SSR) markers in 10 wild populations and the affects of habitat fragmentation on the spatial distribution of genetic variation within and among populations also will be discussed. The combination of paternity analysis from SSR markers and the study of the breeding system will be used for estimating short-term rates of outcrossing and selfing frequencies, and mating system within populations; the pollen-mediated gene flow dynamics characteristics and offspring fitness will be tested directly. As a result, we will establish the effective conservation practices include ex situ or in situ conservation and determined the devising sampling strategies. The understanding of genetic variation will help us to analysis the potential variation in the future and is essential for the establishment of an effective and efficient conservation practices for S. mileensis. .At the same time, the project will be referenced for the conservation and sustainable use of endangered or sub-endangered plants.

本项目拟运用繁殖生物学、居群遗传学和分子生物学的原理及方法，对特有区域药用植物青叶胆进行繁育系统及遗传多样性研究。通过对青叶胆性系统、开花物候、传粉生态学、基本繁育系统和结实结籽特性等的研究，探明影响青叶胆有性生殖过程的主要因子，确定繁育系统相互作用的关键因子；通过开发青叶胆SSR分子标记，分析其10个野生居群遗传多样性水平和遗传结构，揭示青叶胆居群间及居群内由于片断化生境形成的各亚居群间遗传变异空间分布特征及其形成机制；将SSR分子标记进行的亲本分析用于繁育系统的研究，以获得居群的自交率和异交率，确定居群内的交配格局，直接测量以花粉为媒介的基因流动态、基因流时间格局及后代适合度；结合居群遗传分化和稀有等位基因分布等特点，提出青叶胆迁地保护的取样策略；对其居群遗传结构现状和未来变化趋势进行分析，从而提出对青叶胆资源的有效保护措施。

本项目以青叶胆为研究对象，开展资源调查、形态学、性系统、开花物候、传粉生态学、基本繁育系统、结实结籽特性、组织培养、胚胎学、细胞学、化学计量学、遗传多样性分析等方面工作。研究表明：青叶胆仅分布于云南弥勒-开远海拔1300~1750 m的荒坡稀疏小灌木坡柳丛或黄茅草丛；其在分布区域主要为聚集型，各居群生境较为一致，存在生态地理隔离，片断化明显。各居群植株形态变异不大。其单花期2-3 d，居群花期约120 d；繁育系统属于异交，具有一系列机制保证异花授粉，但具很高的自交亲和性，属延迟自交类型；传粉生态学研究表明片断化居群的有性生殖系统受到花粉量和访花昆虫数量的影响；不同交配方式后代种子萌发率和萌发势差异不具有统计学意义（P＞0.05）。有性生殖过程正常，其花药4室，花药壁为基本型，成熟花粉为2-细胞或3-细胞类型；雌配子体发育为蓼型；胚乳发育为核型；胚胎发育为茄型；果实成熟时，种子发育至早心形胚阶段。青叶胆各居群染色体数目均为2n=18，核型公式2n=2x=18=18 m，均为比较对称的1A型。青叶胆中獐牙菜苦苷含量与经度呈极显著负相关 (R= - 0.592，p < 0.01)，高海拔有利于植株中当药苷构成比例的增加 (R = 0.245，p < 0.05)；地理因子对植株中龙胆苦苷含量变化影响不显著 (p > 0.05)；为寻找青叶胆的替代药源，以其同属3种植物为材料，建立超高效液相色谱指纹图谱及紫外-可见光指纹图谱，绘制标准曲线对獐牙菜苦苷进行定量分析，超高效液相色谱数据被用于相似性分析及主成分分析。为进行青叶胆遗传多样性分析，研究建立了能稳定用于青叶胆EST-SSR分子标记的20 uL最佳反应体系；采用Illumina测序平台，构建了青叶胆组培苗植株的转录组数据库，并对其进行生物信息学分析；用Primer5软件，以含不同主导重复基元类型SSR位点的unigene序列设计合成39对SSR引物，筛选出具有清晰扩增产物的引物28对；取20份青叶胆DNA对筛选出的引物进行多态性检测，对青叶胆遗传多样性进行研究，结果表明，在总的遗传变异中有73.16%的变异存在于居群之间，而居群内的遗传变异占26.84%。. 通过项目的实施，在国内外刊物发表研究论文13篇，其中SCI收录2篇；培养硕士研究生4人，获硕士学位1人；晋升教授2人，副教授1人。