蓝莓花青苷生物合成相关miRNAs的鉴定及其作用机理研究

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenous, non-coding, small RNAs, which regulate gene expression mainly via cleavage-induced degradation of mRNAs in plants. Recently, increasing evidences indicate that miRNAs play vital roles in the regulation of anthocyanin synthesis. Blueberry (Vaccinium. corymbosum) is an important small berry fruit crop with economical and nutritional value and rich of anthocyanin. However, it is totally unknown about the miRNAs and their targets involved in anthocyanin synthesis of blueberry fruit. In this study, using high-throughput sequencing of small RNAs and degradome fragments, the miRNAs and its targets probably related to anthocyanin synthesis in blueberry fruit will be identified. For further understanding of the biological functions of these miRNAs response to anthocyanin biosynthesis, the expression pattern analysis of candidate miRNAs during different tissues and fruit developing stages of blueberry will be done in this project. Moreover, by genetic transformation methods, over-expressing of miRNAs mutants of Arabidopsis and blueberry will be created, and the anthocyanin content and the relationship between miRNA and the key genes related to anthocyanin biosynthesis will be analyzed to identify the key miRNAs. Furthermore, combining RACE, yeast one-hybrid, yeast two-hybrid, and BiFC techniques, the interaction between targets will be studied further. Finally, the function and probable mechanism of 1-2 key miRNAs and its targets response to anthocyanin synthesis in blueberry will be elucidated.

miRNAs是一类内源非编码小RNA，在基因表达调控方面扮演着核心角色。蓝莓是最富含花青苷的果实之一，极具营养价值，然而至今为止，关于蓝莓花青苷生物合成调控机理的相关研究还少有报道。本项目将miRNAs调控与蓝莓果实花青苷生物合成相结合，以花青苷合成关键时期（白果期和蓝果期）的蓝莓果实为主要研究对象，运用高通量miRNA及降解组测序技术，筛选出可能参与调控蓝莓花青苷合成的miRNAs及其靶标；利用遗传转化手段，在拟南芥和蓝莓中创制miRNA过表达突变体，分析花青苷含量变化及与花青苷合成相关基因的关系；并采用RACE、酵母单杂交、酵母双杂交与BiFC相结合的策略研究miRNA的靶标之间的相互作用。综合几部分的研究结果，旨在建立蓝莓miRNAs、靶标基因、花青苷合成相关基因与蓝莓花青苷生物合成间的关联，从而深入解析关键1-2个miRNAs介导调控蓝莓花青苷生物合成的作用机制。

微小RNA（miRNAs）是一类内源的非编码小分子RNA。在植物中，miRNA通过诱导靶标mRNA的降解从而发挥功能，在基因表达调控方面扮演着核心角色。近年来，越来越多的研究表明miRNA在花青苷生物合成过程中具有重要的调控功能。蓝莓（Vaccinium. corymbosum）是一类重要的小浆果作物，因其富含花青苷而具有较高的营养和经济价值。然而至今，关于蓝莓花青苷生物合成调控机理的相关研究还少有报道。本项目通过小RNA及降解组测序与分析，基于WF和BF文库数据信息，鉴定到了178对miRNA及其靶标基因，并利用RLM-RACE和qRT-PCR技术对部分miRNA/target组合进行了验证，其中miR156/VcSPL是本研究关注的重点。为了验证克隆所得VcMIR156基因的真实性，本研究在拟南芥中创制了VcMIR156aox过表达突变体并与购自ABRC种子库的MIR156下调突变体MIM156杂交，获得的双突变体回复了VcMIR156aox莲座叶数量多的表型。为了探究Vco-miR156在蓝莓果实发育过程中的功能，本项目利用农杆菌介导的叶盘法构建蓝莓VcMIR156aox过表达突变体，VcMIR156a的过表达通过调节花青苷合成关键基因（VcCHS、VcF3H和Vc3-GT）的表达促进花青苷在蓝莓叶片中的生物合成与积累。与之相对的，其靶标基因VcSPL12则是显著降低了AtDFR、AtPAP1和AtANS等花青苷和成调控基因的表达而抑制了花青苷的合成。值得注意的是，VcSPL12在蓝莓绿果期具有较高的表达量，而VcMIR156a转录本主要在果实成熟初期的白果期表达，此时的VcSPL12表达量正急剧下降。上述结果表明了VcMIR156a–VcSPL12作为重要的调控枢纽组合参与蓝莓花青苷生物合成过程中。为了进一步挖掘参与VcMIR156a–VcSPL12模块调控蓝莓果实着色的其他因子，本研究以蓝莓根叶为材料构建了酵母双杂交文库，并以VcSPL为诱饵蛋白，筛选到2个互作蛋白（WAV3和HCF137），是否在花青苷合成过程中发挥功能仍需进一步探究。本项目研究结果为在miRNA水平上研究蓝莓的生长发育尤其是果实成熟相关过程的功能作用开创新起点，也为在其它物种中展开相应研究提供研究模式，最终为优质蓝莓品种的改良及培育提供重要的理论依据和研究思路。