FoxO3转录因子调节小鼠成肌细胞增殖／分化的信号通路研究

Forkhead transcription factor plays a critical role in the regulation of muscle stem cell differentiation,but the mechanism remains elusive.In our previous work,we made DNA binding profiles of FoxO3 during proliferation,initial differentiation,differentiation in mouse myoblast C2C12 cell line.RNA interference technique was used to knock down the FoxO3 and a series of target genes’ expression level changed,but the mechanism behind this phenomenon is unknown.By further bioinformatic analysis,we found that the genes whose expression level changed with FoxO3 knocking down are involved in Wnt,MAPK,NF-κB,Notch cell signaling pathways,moreover,maybe there is cross talking among those signaling pathways.Therefore,we hypothesize that FoxO3 is regulated by one or some of those signaling pathways,then FoxO3 regulates the expression level of target genes.This hypothesis may be the new mechanism of muscle stem cell differentiation.RNA interference,chromatin immunoprecipitation-sequencing,bioinformatic analysis,RT-qPCR,Western-Blot,etc,will be applied to our research to prove our hypothesis from cellular level to the molecular level.The study will provide new ideas and new targets for diseases in which muscles are involved.

Forkhead转录因子家族在肌肉干细胞分化过程中起重要的调控作用，但机制还不是非常清楚。在我们的前期研究中，运用染色质免疫沉淀－测序技术（ChIP-seq）绘制FoxO3在小鼠成肌细胞增殖、分化起始、终末分化各个阶段DNA结合谱。使用RNA干扰技术敲低FoxO3后发现一系列的靶基因表达发生变化，但FoxO3调控靶基因的具体机制需要进一步探讨。通过生物信息学分析我们发现FoxO3被敲低后表达发生变化的基因与Wnt、MAPK、NF-κB、Notch信号通路有关。因此我们推测肌肉干细胞分化过程中，上述信号通路中的一条或几条调节FoxO3转录因子，进而调控下游靶基因的表达，可能是肌肉干细胞分化的新机制。我们拟应用RNA干扰、ChIP-seq、生物信息学分析、RT-qPCR、Western-Blot等技术，从细胞－分子层次证明我们的假说。本研究将为累及肌肉的疾病防治提供新思路和新靶点。

FoxO作为Forkhead转录因子家族中的一个亚族，参与调控细胞命运决定、细胞分化、细胞凋亡、细胞衰老、细胞代谢和细胞内癌基因表达的抑制等重要的生物学过程。FoxO3是哺乳动物FoxO转录因子亚家族的成员之一，目前一系列研究揭示了FoxO3在干细胞干性维持、细胞静息状态维持、正常细胞周期维持中发挥至关重要的作用。肌肉干细胞是成体干细胞的一种，是哺乳动物肌肉再生的主导力量。与在其他成体干细胞中一样，FoxO在肌肉干细胞中同样也发挥重要的调控作用。FoxO3可以通过调控MyoD影响肌肉分化进程。而在终末分化的肌肉细胞中，FoxO1和FoxO3可以在饥饿条件下通过激活糖代谢相关基因PDK-4、PPARδ、PGC1α等的表达，促进糖原分解，增加糖异生来保持终末分化肌肉细胞内的葡萄糖平衡。同一转录因子在不同的细胞背景下功能发生显著变化的分子机理目前还不清楚。FoxO还是很多信号通路的下游转录因子，其活性可受磷酸化、乙酰化和蛋白酶水解调节。不同信号通路如何通过FoxO综合在一起，彼此协调反应的机制目前还不清楚。在本项目的资助下，我们对小鼠成肌细胞系及小鼠原代细胞染色体免疫共沉淀实验的结果进行生物信息学分析，发现了FoxO3调控的靶基因，并经过RNA干扰、实时定量PCR进行了验证。发现了FoxO3在C2C12不同阶段DNA结合的序列特征、碱基偏好。通过蛋白质谱分析发现了与FoxO3相互作用的蛋白，其中TGF-β可引起下游靶基因表达水平的变化，提示TGF-β为FoxO3的调控因素之一。动物实验发现，与野生型小鼠相比，FoxO3敲除的小鼠肌肉分化成熟受到抑制。我们的研究数据揭示了调控FoxO3的上游信号通路、FoxO3的结合碱基偏好、FoxO3的下游靶基因，系统阐述了FoxO3在肌肉分化中的作用机制，在动物模型中验证了体外实验的结果。